ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
EMITENT
  • MINISTERUL AGRICULTURII ŞI DEZVOLTĂRII RURALE
    • Publicat în  MONITORUL OFICIAL nr. 524 din 2 august 2007



    În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanţa Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, aprobată cu modificări prin Legea nr. 214/2001,văzând Referatul de aprobare nr. 292.478 din 1 iunie 2007 al Agenţiei Naţionale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale,în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 385/2007 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale,ministrul agriculturii şi dezvoltării rurale emite prezentul ordin.  +  Articolul 1Prezentul ordin stabileşte măsurile care se aplică împotriva bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cunoscută anterior sub denumirea de Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, denumită în continuare organism, cu privire la plantele-gazdă ale organismului, prevăzute în anexa nr. I secţiunea I, denumite în continuare material de plantare, în scopul: a) localizării şi determinării distribuţiei; b) prevenirii apariţiei şi răspândirii; şi c) împiedicării răspândirii şi controlului în vederea eradicării, dacă a fost semnalată.  +  Articolul 2 (1) Organismele oficiale responsabile din România, respectiv unităţile fitosanitare judeţene şi a municipiului Bucureşti, efectuează inspecţii oficiale sistematice anuale asupra materialului de plantare originar din raza lor de activitate. (2) În scopul identificării altor posibile surse de contaminare care ameninţă producţia materialului de plantare, organismele oficiale responsabile efectuează o evaluare a riscului şi, cu excepţia cazului în care în timpul evaluării nu se identifică niciun risc de răspândire a organismului, desfăşoară inspecţii în zonele de producţie a materialului de plantare pentru detectarea organismului asupra altor plante decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, inclusiv asupra plantelor-gazdă solanacee sălbatice, precum şi asupra apei de suprafaţă, asupra deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare, utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare. În funcţie de riscul identificat se determină extinderea inspecţiilor prevăzute la alin. (1). (3) Organismele oficiale responsabile pot, de asemenea, să desfăşoare inspecţii oficiale pentru detectarea organismului pe materiale, cum ar fi mediu de creştere, sol şi deşeuri solide rezultate din procesările industriale sau locurile de ambalare.  +  Articolul 3 (1) Inspecţiile oficiale prevăzute la art. 2 sunt efectuate: a) asupra materialului de plantare, în conformitate cu prevederile anexei nr. I secţiunea II pct. 1; b) asupra plantelor-gazdă, altele decât materialul de plantare prevăzut la art. 1, şi asupra apei, inclusiv asupra deşeurilor lichide, şi, dacă este cazul, sunt prelevate probe şi supuse testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, în conformitate cu metodele corespunzătoare; c) după caz, asupra altor materiale, în conformitate cu metodele corespunzătoare. (2) Detaliile suplimentare cu privire la procedurile de inspecţie prevăzute la alin. (1), numărul, originea, eşalonarea şi perioada prelevării probelor sunt elaborate de Laboratorul Central pentru Carantină Fitosanitară şi aprobate de Agenţia Naţională Fitosanitară din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, pe baza principiilor ştiinţifice, statistice şi a biologiei organismului, luând în considerare sistemul particular de producţie a materialului de plantare şi, după caz, al altor plante-gazdă ale organismului.  +  Articolul 4 (1) Detaliile şi rezultatele inspecţiilor oficiale prevăzute la art. 2 trebuie notificate anual celorlalte state membre şi Comisiei Europene, denumită în continuare Comisie, în conformitate cu prevederile anexei nr. I secţiunea II pct. 2. Aceste notificări sunt prezentate până la 1 iunie, cu excepţia celor referitoare la cartofii de sămânţă obţinuţi din propria exploataţie, pentru care notificarea este prezentată până la 1 septembrie. Detaliile şi rezultatele recoltelor se referă la producţia anului precedent. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului Permanent pentru Sănătatea Plantelor, denumit în continuare Comitet. (2) În conformitate cu procedura stabilită la art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Ordonanţei Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, pot fi adoptate: a) metode adecvate pentru inspecţiile şi testele de laborator prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. b); b) metode adecvate pentru inspecţiile prevăzute la art. 3 alin. (1) lit. c); c) detalii suplimentare ale inspecţiilor prevăzute la art. 3 alin. (2) pentru asigurarea unor niveluri comparabile de asigurare între statele membre.  +  Articolul 5Organismele oficiale responsabile asigură ca apariţia suspectată sau prezenţa confirmată a organismului pe raza lor de activitate să fie comunicată Agenţiei Naţionale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale.  +  Articolul 6În cazul unei apariţii suspectate a organismului, Laboratorul Central pentru Carantină Fitosanitară sau alte laboratoare aprobate de Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizând pentru materialul de plantare metoda corespunzătoare, conform anexei nr. II şi în conformitate cu condiţiile prevăzute în anexa nr. III pct. 1, sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată oficial, în scopul confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului. În cazul confirmării prezenţei organismului, se aplică prevederile anexei nr. III pct. 2.  +  Articolul 7 (1) În aşteptarea confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului conform art. 6, în cazurile de apariţie suspectată în care: a) s-au constatat simptome de diagnostic cauzate de organism şi un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform anexei nr. II secţiunea I pct. 1 şi secţiunea II a fost identificat; sau b) a fost identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform anexei nr. II secţiunea I pct. 2 şi secţiunea III, Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale prin unităţile fitosanitare:1. interzice circulaţia plantelor şi tuberculilor din toate recoltele, loturile sau transporturile din care au fost prelevate probele, aceasta putându-se face doar sub control oficial şi cu condiţia să se fi stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului;2. aplică măsurile necesare pentru identificarea originii apariţiei suspectate;3. introduce măsuri de precauţie suplimentare adecvate, bazate pe gradul de risc estimat, în special, în legătură cu producţia materialului de plantare şi cu circulaţia loturilor de cartofi de sămânţă, alţii decât cei prevăzuţi la pct. 1, produşi la locul de producţie de unde s-au prelevat probele prevăzute la pct. 1, în scopul prevenirii oricărei răspândiri a organismului. (2) În cazurile apariţiilor suspectate unde există un risc de contaminare a materialului de plantare sau a apei de suprafaţă din sau într-un alt stat membru (state membre), statul membru pe raza căruia apariţia suspectată a fost înregistrată notifică de îndată, în conformitate cu riscul identificat, detaliile apariţiei suspectate altui stat sau altor state membre implicate şi corespunzător cooperării între statele membre menţionate. Statul membru (statele membre) care a (au) notificat introduce (introduc) măsuri de precauţie conform alin. (1) pct. 3 şi iau măsuri suplimentare corespunzătoare, conform art. 6 şi alin. (1) din prezentul articol. (3) În conformitate cu procedura stabilită în art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, sunt adoptate măsurile prevăzute la alin. (1) pct. 3.  +  Articolul 8 (1) Dacă în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate efectuate pentru materialul de plantare în conformitate cu metoda prevăzută în anexa nr. II sau, în toate celelalte cazuri, cu orice altă metodă aprobată oficial se confirmă prezenţa organismului într-o probă prelevată în conformitate cu prezentul ordin, organismele oficiale responsabile, având în vedere principiile ştiinţifice fundamentate, biologia organismului şi producţia specifică, comercializarea şi sistemele de procesare a plantelor-gazdă ale organismului, dispun măsurile prevăzute la alin. (2), (3) şi (4). (2) În cazul materialului de plantare organismele oficiale responsabile: a) deschid o investigaţie pentru determinarea extinderii şi sursei sau surselor primare de contaminare, în conformitate cu prevederile anexei nr. IV, cu testări suplimentare în conformitate cu art. 6, cel puţin asupra stocurilor de cartofi de sămânţă înrudiţi prin clonare; şi b) desemnează ca fiind contaminate materialul de plantare, transportul şi/sau lotul din care s-a prelevat proba şi utilajele, vehiculul, vasul, depozitul sau părţi din acestea şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul de plantare din care a fost prelevată proba; c) desemnează ca fiind contaminate, dacă este cazul, câmpul sau câmpurile, unitatea ori unităţile de producţie de culturi protejate şi locul sau locurile de producţie de unde s-a recoltat materialul de plantare şi din care a fost prelevată proba; d) pentru probele prelevate în perioada de vegetaţie desemnează ca fiind contaminate câmpul sau câmpurile, locul ori locurile de producţie şi, dacă este cazul, unitatea sau unităţile de producţie de culturi protejate din care a fost prelevată proba; şi e) determină, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 1, extinderea contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin legături de producţie, irigare ori stropire sau printr-o înrudire clonală cu materialul desemnat contaminat; şi f) demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu prevederile lit. b), c) şi d), a determinării extinderii contaminării probabile în conformitate cu lit. e) şi a răspândirii posibile a organismului, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 2 (i). (3) În cazul culturilor de plante-gazdă, altele decât cele prevăzute la alin. (2), la care producţia de material de plantare este identificată ca risc, organismele oficiale responsabile: a) deschid o investigaţie în conformitate cu prevederile alin. (2) lit. a); şi b) desemnează ca fiind contaminate plantele-gazdă ale organismului de la care a fost prelevată proba; şi c) determină contaminarea probabilă şi demarchează o zonă în conformitate cu alin. (2) lit. e) şi, respectiv, lit. f), în legătură cu producţia de material de plantare. (4) În cazul apelor de suprafaţă, inclusiv al deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare a materialului de plantare, şi pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice asociate, acolo unde producţia de material de plantare este identificată ca risc prin irigaţie, stropire sau inundare cu apă de suprafaţă, organismele oficiale responsabile: a) deschid o investigaţie, inclusiv o inspecţie în perioade corespunzătoare, pentru probele prelevate din apele de suprafaţă şi, dacă sunt prezente, pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice, în vederea stabilirii extinderii contaminării; şi b) desemnează ca fiind contaminată apa de suprafaţă din care au fost prelevate proba sau probele, corespunzătoare extinderii contaminării şi în baza investigaţiilor efectuate în conformitate cu lit. a); şi c) determină contaminarea probabilă şi demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu lit. b) şi a posibilei răspândiri a organismului, ţinând seama de prevederile anexei nr. V pct. 1 şi pct. 2 (îi).  +  Articolul 9 (1) Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, prin Agenţia Naţională Fitosanitară, notifică de îndată altor state membre şi Comisiei, în conformitate cu prevederile anexei nr. V pct. 3, orice contaminare stabilită conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) şi alin. (4) lit. b) şi detaliile zonei demarcate conform art. 8 alin. (2) lit. f) şi, dacă este cazul, conform art. 8 alin. (4) lit. c). Detaliile notificării efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi prezentate Comitetului. (2) Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, prin Agenţia Naţională Fitosanitară, în acelaşi timp, va prezenta Comisiei notificări suplimentare conform anexei nr. V pct. 4. Detaliile notificării efectuate conform prevederilor acestui alineat pot fi prezentate Comitetului.  +  Articolul 10În urma notificării în conformitate cu prevederile art. 9, celelalte state membre vizate în notificare deschid o investigaţie în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. a) şi, dacă este cazul, cu art. 8 alin. (4) lit. a) şi iau măsuri suplimentare, după caz, în conformitate cu art. 8 şi 9.  +  Articolul 11Materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) nu poate fi plantat şi de aceea, sub controlul organismelor oficiale responsabile, este supus uneia dintre dispoziţiile anexei nr. VI pct. 1, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.  +  Articolul 12Materialul de plantare desemnat ca fiind probabil contaminat conform art. 8 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c), inclusiv materialul de plantare pentru care a fost identificat un risc, produs în locuri de producţie desemnate ca probabil contaminate în conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e), nu poate fi plantat şi, sub controlul organismelor oficiale responsabile, este utilizat sau eliminat în conformitate cu prevederile anexei nr. VI pct. 2, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului.  +  Articolul 13Orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau părţi din acestea şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare desemnat ca fiind contaminat conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) sau desemnat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu prevederile art. 8 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c), este decontaminat sau distrus, utilizându-se metodele prevăzute în anexa nr. VI pct. 3. După decontaminare niciun astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind contaminat.  +  Articolul 14Fără a prejudicia măsurile implementate conform prevederilor art. 11-13, organismele oficiale responsabile aplică în zona demarcată conform art. 8 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) o serie de măsuri conform prevederilor anexei nr. VI pct. 4.1 şi 4.2. Detaliile acestor măsuri se notifică anual celorlalte state membre şi Comisiei. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului.  +  Articolul 15 (1) Cartofii de sămânţă trebuie să îndeplinească cerinţele Hotărârii Guvernului nr. 563/2007 şi să provină, în linie directă, dintr-un material obţinut în cadrul unui program aprobat oficial, găsit liber de organism în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda corespunzătoare prevăzută în anexa nr. II. (2) Testarea prevăzută la alin. (1) este efectuată: a) în cazurile în care a fost confirmată prezenţa organismului în producţia de cartofi de sămânţă, se testează:1. materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial şi clonele de bază de cartofi de sămânţă;2. toate clonele de bază de cartofi de sămânţă sau materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial, în cazurile în care s-a stabilit că nu există nicio relaţie clonală; şi b) în alte cazuri, pe fiecare plantă obţinută din clonele selectate iniţial sau eşantioanele reprezentative de cartofi de sămânţă de bază ori materialul timpuriu de propagare. (3) În conformitate cu procedura prevăzută la art. 19 alin. (2) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007, pot fi adoptate următoarele prevederi:- regulile detaliate ale aplicării prevederilor alin. (2) lit. a);- regulile privind eşantioanele reprezentative prevăzute la alin. (2) lit. b).  +  Articolul 16Deţinerea şi manipularea organismului sunt interzise.  +  Articolul 17Fără a prejudicia prevederile Hotărârii Guvernului nr. 563/2007, Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, prin Agenţia Naţională Fitosanitară, poate aproba derogări de la măsurile prevăzute la art. 11-14 şi 16, pentru testări sau în scopuri ştiinţifice şi lucrări pentru selecţii varietale.  +  Articolul 18 (1) Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, prin Agenţia Naţională Fitosanitară, poate adopta măsuri suplimentare sau mai stricte pentru combaterea organismului sau pentru prevenirea răspândirii lui, în conformitate cu prevederile Hotărârii Guvernului nr. 563/2007. (2) Ministerul Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, prin Agenţia Naţională Fitosanitară, notifică detaliile măsurilor prevăzute la alin. (1) celorlalte state membre şi Comisiei. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Comitetului.  +  Articolul 19Anexele nr. I-VII fac parte integrantă din prezentul ordin.  +  Articolul 20Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 98/57/CEE privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. L 0057 din 30 iulie 2006, modificată şi completată prin Directiva Consiliului 2006/63, publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JOUE) nr. L 206 din 27 iulie 2006.  +  Articolul 21Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 632/2002 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 327 şi 327 bis din 14 mai 2003, se abrogă.  +  Articolul 22Prezentul ordin se publică în Monitorul Oficial al României, Partea I.Ministrul agriculturiişi dezvoltării rurale,Decebal Traian RemeşBucureşti, 13 iulie 2007.Nr. 586.  +  Anexa I  +  Secţiunea I Lista plantelor-gazdă ale bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. prevăzute la art. 1Plante (inclusiv tuberculi), altele decât seminţele propriu-zise de Solanum tuberosum L (cartof)Plante, altele decât fructele şi seminţele de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw (tomate)  +  Secţiunea II Inspecţii1. Inspecţiile prevăzute la art. 3 din ordin se bazează pe biologia organismului şi pe sistemele de producţie proprii:(i) în cazul cartofului:- în perioade corespunzătoare, inspecţia vizuală a culturii şi/sau prelevarea de probe atât de cartofi de sămânţă, cât şi de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetaţie sau în perioada de depozitare. Aceste probe sunt supuse unei inspecţii vizuale prin secţionarea tuberculilor; şi- în cazul cartofilor de sămânţă şi, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizându-se metoda stabilită în anexa nr. II;(îi) în cazul tomatelor:- inspecţie vizuală, în perioade corespunzătoare, cel puţin în perioada de vegetaţie a plantelor destinate replantării în scop profesional.2. Notificarea inspecţiilor prevăzute la art. 4 alin. (1) din ordin include:(i) în cazul inspecţiilor asupra cartofilor:- suprafaţa totală estimată cultivată, în hectare, cu cartofi de sămânţă şi alte tipuri de cartofi;- stratificarea după categorie a cartofilor de sămânţă şi de consum şi, după caz, pe regiune;- numărul şi perioada de prelevare a probelor pentru testare;- numărul inspecţiilor vizuale din câmp;- numărul de inspecţii vizuale asupra tuberculilor şi dimensiunea probei;(îi) în cazul inspecţiilor la plantele de tomate destinate replantării în scop profesional, în perioada de vegetaţie:- numărul total estimat de plante;- numărul inspecţiilor vizuale;(iii) în cazul inspecţiilor asupra plantelor-gazdă, altele decât cartofi şi tomate, inclusiv plante-gazdă solanacee sălbatice:- speciile;- numărul şi perioada prelevării probelor;- zona/râul de unde au fost prelevate probele, acolo unde este cazul;- metoda de analiză;(iv) în cazul inspecţiilor asupra apei şi deşeurilor lichide deversate din procesarea industrială sau din locurile de ambalare:- numărul şi perioada prelevării probelor;- zona/râul/ locul de prelevare a probelor, acolo unde este cazul;- metoda de analiză.  +  Anexa IIPROTOCOLUL DE TESTAREpentru diagnoza, detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.SCOPUL PROTOCOLULUI DE TESTAREProtocolul prezentat descrie diversele proceduri implicate în:(i) diagnoza putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a veştejirii bacteriene la plantele de cartof, tomate, precum şi la alte câteva plante-gazdă;(îi) detecţia bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof, plante de cartof, tomate şi în alte plante-gazdă, în apă sau în sol;(iii) identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum.PRINCIPII GENERALEProtocoalele optimizate pentru diversele metode, validarea reactivilor şi detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste şi controale figurează în apendici. O listă a laboratoarelor care realizează optimizarea şi validarea protocoalelor este prevăzută în apendicele 1.Dat fiind faptul că protocoalele implică detecţia unui organism dăunător care trebuie pus sub carantină şi includ utilizarea de culturi viabile de Ralstonia solanacearum, în calitate de material de control, este necesară aplicarea de proceduri de carantină corespunzătoare care prevăd instalaţii adecvate de eliminare a deşeurilor şi în condiţiile existenţei unor licenţe corespunzătoare eliberate de către autorităţile oficiale de carantină.Parametrii testelor trebuie să garanteze o detecţie coerentă şi reproductibilă a nivelurilor de Ralstonia solanacearum la pragurile stabilite prin metodele selecţionate.Pregătirea exactă a controalelor pozitive este imperativă.Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manipularea şi păstrarea corectă a reactivilor şi toate măsurile menite să împiedice contaminarea între probe, de exemplu, separarea controalelor pozitive şi a probelor testate. Trebuie aplicate standarde de control de calitate pentru a se evita erori administrative şi de alt gen, în special în ceea ce priveşte etichetarea şi documentarea.O apariţie suspectă, în sensul art. 7 alin. (1) din ordin, implică un rezultat pozitiv al testelor de diagnostic sau de detecţie realizate asupra unei probe în conformitate cu diagramele funcţionale prezentate în continuare. Un prim test de detecţie pozitiv: testul de imunofluorescenţă (IF), testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR), testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH), izolare selectivă trebuie confirmat de un al doilea test de detecţie bazat pe un alt principiu biologic.În cazul în care primul test de detecţie este pozitiv, se suspectează o contaminare cu Ralstonia solanacearum şi trebuie efectuat un al doilea test de detecţie. În cazul în care al doilea test de detecţie este pozitiv, presupunerea se confirmă (apariţie suspectată) şi trebuie continuate testele în conformitate cu procedura. În cazul în care al doilea test de detecţie este negativ, proba este considerată ca fiind necontaminată cu Ralstonia solanacearum.Prezenţa confirmată menţionată la art. 8 alin. (1) din ordin implică izolarea şi identificarea unei culturi pure de Ralstonia solanacearum cu confirmarea patogenităţii.  +  Secţiunea I Aplicarea protocolului de testare1. Procedura de detecţie pentru diagnoza veştejirii bacteriene (Ralstonia solanacearum) la tuberculi de cartof, plante de cartof, plante de tomate sau alte plante-gazdă care prezintă simptome de veştejire bacterianăProtocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof şi plantelor cu simptome tipice sau suspecte de veştejire bacteriană. Presupune un test de detecţie rapidă, izolarea agentului patogen din ţesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.Prezentarea diagramei   ┌──────────────────────────────────────────────────────────────┐   │Tubercul(i) de cartof(i) sau planta(palante) gazda de cartofi,│   │tomate sau alte plante gazda care prezinta simptome suspecte │   │de vestejire bacteriana*1) │   └────────────────────────┬─────────────────────────────────────┘                            │                            │ ┌───────────────────────────────────────┐                            │ │TESTE DE SELECTIE RAPIDĂ*2) │                            │ │A se efectua cel puţin unul dintre │                            ├───┤urmatoarele teste pentru un diagnostic │                            │ │prezumtiv: │                            │ │- test de eliminare a exudatului din │                            │ │tesutul vascular al tulpinii*3) │                            │ │- test de detectare a granulelor - │                            │ │hidroxibutirat*4) │                            │ │- test de sero-aglutinare*5) │                            │ │- test IF*6)/test FISH*7)/testELISA*8)/│                            │ │testPCR*9) │                            │ └───────────────────────────────────────┘                            │                 ┌──────────┴──────────┐                 │ TEST DE IZOLARE*10) │                 └──────────┬──────────┘                            │                 ┌──────────┴──────────┐                 │Colonii cu morfologie│                 │ tipica*11) │                 └──────────┬──────────┘                            │ ┌───────────────────┐                            │ ┌──────┐ │R.solanacearum │                            ├──────┤NU*12)├────┤ nedetectata │                            │ └──────┘ │proba necontaminata│                            │ │cu R.solanacearum │                            │ └───────────────────┘                         ┌──┴──┐                         │ DA │                         └──┬──┘                            │              ┌─────────────┴───────────────┐              │ Purificare prin subcultura │              └─────────────┬───────────────┘                            │      ┌─────────────────┐ │ ┌───────────────────┐      │ TESTE DE ├───┼───┤ TEST DE │      │ IDENTIFICARE*13)│ │ │ PATOGENITATE*14) │      └─────────────────┘ │ └───────────────────┘                            │              ┌─────────────┴──────────────────┐              │ Cele doua teste confirma o │              │ cultura pura de R.solanacearum │              └─────────────┬──────────────────┘                            │ ┌────┐ ┌──────────────────────┐                            ├─┤ NU ├────┤proba necontaminata cu│                            │ └────┘ │ R.solanacearum │                            │ └──────────────────────┘                          ┌─┴──┐                          │ DA │                          └─┬──┘                            │                  ┌─────────┴────────────┐                  │ proba contaminata cu │                  │ R.solanacearum │                  └──────────────────────┘___________*1) Descrierea simptomelor este prevăzută la secţiunea II.1.*2) Testele de selecţie rapidă uşurează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esenţiale. Un rezultat negativ nu garantează întotdeauna absenţa agentului patogen.*3) Testul de eliminare a exsudatului din ţesutul vascular al tulpinii este descris în secţiunea VI.A.1.*4) Testul de detecţie a granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat în celulele bacteriene este descris în secţiunea VI.A.2.*5) Testele de seroaglutinare asupra exsudatului bacterian sau asupra extractelor din ţesuturile simptomatice sunt descrise în secţiunea VI.A.3.*6) Testul IF asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI.A.5.*7) Testul FISH asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI.A.7.*8) Testul ELISA asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI.A.8.*9) Testul PCR asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI.A.6.*10) În general, agentul patogen se izolează uşor din materialul vegetal simptomatic prin însămânţare pe mediu nutritiv (secţiunea II.3).*11) Morfologia coloniei tipice este descrisă în secţiunea II.3.d).*12) Cultivarea riscă să eşueze în stadiile avansate de infectare din cauza concurenţei sau a înmulţirii bacteriilor saprofite. În cazul în care simptomele bolii sunt caracteristice, dar testul de izolare este negativ, izolarea trebuie repetată, de preferinţă printr-un test de însămânţare pe medii selective.*13) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secţiunea VI. B. O caracterizare subspecifică este facultativă, dar recomandată pentru fiecare caz nou.*14) Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI. C.2. Procedura pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomaticiPrincipiuProtocolul de testare este destinat detecţiei infecţiilor latente ale tuberculilor de cartof. Un rezultat pozitiv a cel puţin două teste de detecţie bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanacearum. Un rezultat pozitiv la un singur test de detecţie nu este suficient pentru a considera proba ca fiind suspectă.Testele de detecţie şi testele de izolare trebuie să permită detecţia a 10^3-10^4 celule pe ml de extract concentrat în suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.Prezentarea diagramei               ┌───────────────────────────────┐               │Proba de tuberculi de cartof*1)│               └─────────────┬─────────────────┘                             │               ┌─────────────┴─────────────────┐               │Extragerea şi concentrarea │               │ agentului patogen*2) │               └─────────────┬─────────────────┘                             │               ┌─────────────┴────────────────────┐               │ TESTELE DE SELECTIE*3) │               │ Test IF*4)/izolare selectiva*5)/ │               │ testPCR*6)/testFISH*7) │               │ Test auxiliar facultativ:ELISA*8)│               └──────────────┬───────────────────┘                              │                  ┌───────────┴────────────────┐                  │ Primul test de selecţie*3) │                  └───────────┬────────────────┘                              │ ┌───────┐ ┌──────────────────────┐                              ├───┤negativ├────┤ R.solanacearum │                              │ └───────┘ │ nedetectat │                           ┌──┴────┐ │proba necontaminata cu│                           │pozitiv│ │ R.solanacearum │                           └───┬───┘ └──────────────────────┘                               │                ┌──────────────┴───────────────┐                │ Al doilea test de selecţie*3)│                └─────────────┬────────────────┘                              │ ┌───────┐ ┌──────────────────────┐                              ├───┤negativ├────┤ R.solanacearum │                              │ └───────┘ │ nedetectat │                           ┌──┴────┐ │proba necontaminata cu│                           │pozitiv│ │ R.solanacearum │                           └───┬───┘ └──────────────────────┘                               │           ┌───────────────────┴───────────────────────┐           │izolare selectiva*5)şi/sau test biologic*9)│           └───────────────────┬───────────────────────┘                               │                 ┌─────────────┴──────────────────┐                 │Colonii cu morfologie tipica*10)│                 └─────────────┬──────────────────┘                               │                               │ ┌──────┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU*11)├───┤ R.solanacearum │                               │ └──────┘ │ nedetectat │                             ┌─┴──┐ │proba necontaminata cu│                             │ DA │ │ R.solanacearum │                             └─┬──┘ └──────────────────────┘                               │                   ┌───────────┴───────────────┐                   │ Purificare prin subcultura│                   └───────────┬───────────────┘  ┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐  │TESTE DE IDENTIFICARE*12├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*13│  └────────────────────────┘ │ └───────────────────────┘              ┌────────────────┴────────────────┐              │ ambele teste confirma o cultura │              │ pura de R.solanacearum │              └────────────────┬────────────────┘                               │ ┌──┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│                               │ └──┘ │ R.solanacearum │                               │ └──────────────────────┘                            ┌──┴─┐                            │ DA │                            └──┬─┘                      ┌────────┴────────────┐                      │proba contaminata cu │                      │ R.solanacearum │                      └─────────────────────┘_____________*1) Mărimea standard a probei este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat probelor mai mici în cazul în care nu sunt disponibili 200 de tuberculi.*2) Extragerea agentului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise în secţiunea III.1.1.*3) În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. A se efectua cel puţin un test rapid de detecţie. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecţie rapidă bazate pe principii biologice diferite pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.*4) Testul IF este descris în secţiunea VI.A.5.*5) Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI.A.4.*6) Testele PCR sunt descrise în secţiunea VI.A.6.*7) Testul FISH este descris în secţiunea VI.A.7.*8) Testele ELISA sunt descrise în secţiunea VI.A.8.*9) Testul biologic este descris în secţiunea VI.A.9.*10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II.3.d).*11) Cultivarea sau testele biologice riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a inhibiţiei de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obţin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecţie, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare din acelaşi extract concentrat sau din ţesutul vascular suplimentar prelevat de la talonul tuberculilor tăiaţi din aceeaşi proba şi, după caz, trebuie testate probele suplimentare.*12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secţiunea VI.B.*13) Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI.C.3. Procedură pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de plante-gazdă de cartofi şi tomate sau alte plante-gazdă asimptomaticePrezentarea diagramei                            ┌─────────────────────────────────┐                            │ Probe de segmente din tulpina*1)│                            └───────────────┬─────────────────┘                                            │                   ┌────────────────────────┴─────────────────────────┐                   │Extragerea şi concentrarea organismului patogen*2)│                   └────────────────────────┬─────────────────────────┘                                            │               ┌────────────────────────────┴──────────────────────┐               │ TESTE PRINCIPALE DE DEPISTARE*3) │               │ Izolare selectiva*4)/testIF*5)/testPCR*6)/ │               │ test FISH*7) │               │Test auxiliar facultativ: ELISA*8),test biologic*9)│               └────────────────────────────┬──────────────────────┘                                            │                                            │                 ┌──────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐                 │ Colonii cu morfologie│ │ │toate testele efectuate│                 │ tipica după ├───┴────┤ sunt negative │                 │ izolare*8 │ └───────────────────────┘                 └─────────────┬────────┘                               │                               │ ┌──────┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU*11)├───┤ R.solanacearum │                               │ └──────┘ │ nedetectat │                             ┌─┴──┐ │proba necontaminata cu│                             │ DA │ │ R.solanacearum │                             └─┬──┘ └──────────────────────┘                               │                   ┌───────────┴───────────────┐                   │ purificare prin subcultura│                   └───────────┬───────────────┘  ┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐  │TESTE DE IDENTIFICARE*12├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*13│  └────────────────────────┘ │ └───────────────────────┘              ┌────────────────┴────────────────┐              │ ambele teste confirma o cultura │              │ pura de R.solanacearum │              └────────────────┬────────────────┘                               │ ┌──┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│                               │ └──┘ │ R.solanacearum │                               │ └──────────────────────┘                            ┌──┴─┐                            │ DA │                            └──┬─┘                      ┌────────┴────────────┐                      │proba contaminata cu │                      │ R.solanacearum │                      └─────────────────────┘_________________*1) Pentru mărimea recomandată a probelor a se vedea secţiunea III.2.1.*2) Extragerea agentului patogen şi metodele de concentrare sunt descrise în secţiunea III.2.1.*3) În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sunt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. A se efectua cel puţin un test rapid de detecţie. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecţie rapidă, bazate pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sunt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sunt necesare alte teste.*4) Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI.A.4.*5) Testul IF este descris în secţiunea VI.A.5.*6) Testele PCR sunt descrise în secţiunea VI.A.6.*7) Testul FISH este descris în secţiunea VI.A.7.*8) Testele ELISA sunt descrise în secţiunea VI.A.8.*9) Testul biologic este descris în secţiunea VI.A.9.*10) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II.3.d).*11) Cultivarea sau testele biologice riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a inhibiţiei de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obţin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecţie, însă testele de izolare sunt negative, trebuie repetate testele de izolare.*12) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolări prezumtive de Ralstonia solanacearum se obţine prin efectuarea testelor descrise în secţiunea VI.B.*13) Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI.C.  +  Secţiunea a II-a Metode detaliate pentru detecţia bacteriei Ralstonia solanacearum la tuberculii de cartof, la plantele-gazdă de cartof şi de tomate sau la alte plante-gazdă cu simptome de vestejire bacteriană1. Simptome (vezi website http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main)1.1. Simptome la cartofPe plante. Stadiul incipient al infecţiei în câmp este reprezentat de veştejirea frunzelor înspre vârful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate şi de revenirea la aspect normal în timpul nopţii. În cursul primelor stadii de veştejire, frunzele rămân verzi, dar mai târziu apare o îngălbenire şi o necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Veştejirea unui lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă şi duce la moartea plantei. Ţesutul vascular în secţiune transversală prin tulpina plantelor veştejite poate deveni brun şi un exsudat lăptos apare la suprafaţa tăieturii sau poate fi extras uşor prin presare. Dacă tulpina secţionată se aşază în poziţie verticală în apă, din ţesutul vascular se elimină un exsudat vâscos asemănător unui firicel.Pe tuberculi. Se secţionează tuberculii de cartof transversal aproape de hil (punctul de inserţie cu stolonul) sau longitudinal până la stolon. În stadiul incipient al infecţiei apare o decolorare galben-sticloasă spre brun-deschis a inelului vascular din care se elimină un exsudat crem-pal în mod spontan după câteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la ţesutul parenchimatos. În stadii avansate, infecţia se propagă la nivelul stolonilor şi al ochilor din care se elimină bacterii ce permit aderarea particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare brun-roşcat uşor adâncite, provocate de colapsul intern al ţesutului vascular. În stadiile avansate ale bolii se dezvoltă putregaiuri fungice şi bacteriene.1.2. Simptome la tomatePe plante. Primul simptom vizibil este veştejirea aparentă a frunzelor tinere. În condiţii favorabile agentului patogen (temperatura solului circa 25°C, umiditate saturată), în câteva zile apar epinastia şi veştejirea unei părţi din plantă sau a întregii plante, ce duc la colapsul total al plantei. În condiţii mai puţin favorabile (temperatura solului sub 21°C), veştejirea este mai puţin pronunţată, dar se poate dezvolta un număr mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă observarea unei benzi subţiri unsuroase de-a lungul tulpinii, plecând de la baza acesteia, ce dovedeşte necroza sistemului vascular. În cazul în care tulpina este secţionată transversal, din ţesuturile vasculare brun-decolorat ale tulpinii se elimină un exsudat bacterian alb sau gălbui.1.3. Simptome la alte plante-gazdăSolanum dulcamara şi Solanum nigrum. În condiţii naturale rareori se observă simptome de veştejire la aceste plante-gazdă, cu excepţia cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25°C sau nivelurile de inoculum sunt extrem de ridicate (de exemplu, pentru Solanum nigrum care se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomate bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sunt identice cu cele descrise pentru tomată. Plantele de Solanum dulcamara care nu se veştejesc şi se dezvoltă cu tulpina şi rădăcina în apă pot prezenta o uşoară decolorare brună a ţesutului vascular pe partea transversală a tulpinii sau pe părţile tulpinii aflate sub apă. În cazul în care se pune o tulpină tăiată în poziţie verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian chiar în absenţa simptomelor de veştejire.2. Teste rapide de detecţieTestele rapide de detecţie facilitează diagnosticul prezumtiv, dar nu sunt esenţiale. Se folosesc unul sau mai multe dintre următoarele teste validate:2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină (vezi secţiunea VI.A.1)2.2. Detecţia granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat (PHB)Granulele tipice de PHB din celulele de Ralstonia solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B (vezi secţiunea VI.A.2) a frotiurilor de exsudat bacterian din ţesutul infectat, fixate prin flacără pe o lamă de microscop.2.3. Testul serologic de aglutinare (vezi secţiunea VI.A.3)2.4. Alte testeAlte teste rapide de detecţie sunt testul IF (vezi secţiunea VI.A.5), testul FISH (vezi secţiunea VI.A.7), testele ELISA (vezi secţiunea VI.A.8) şi testele PCR (vezi secţiunea VI. A.6).3. Procedura de izolare a) Se îndepărtează exsudatul sau secţiunile de ţesut decolorat de la nivelul inelului vascular al tuberculului de cartof sau din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, plantei de tomată sau de alte plante-gazdă veştejite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă 5-10 minute pe masă. b) Se prepară o serie de diluţii zecimale ale suspensiei. c) Se transferă 50-100 f2μl de suspensie şi de diluţii pe un mediu nutritiv general (NA, YPGA sau SPA; vezi apendicele 2) şi/sau pe mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 2) şi/sau pe un mediu selectiv validat (de exemplu, SMSA; vezi apendicele 2). Se însămânţează printr-o tehnică corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, separat, se însămânţează plăci Petrii cu o suspensie diluată de celule de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv. d) Se incubează plăcile timp de 2-6 zile la 28°C.- Pe mediu nutritiv general, izolatele virulente de Ralstonia solanacearum formează colonii fluide, cu margini neregulate, plate, albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează mici colonii rotunjite, nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă.- Pe mediu tetrazoliu Kelman şi pe mediu SMSA, verticilele sunt de culoare roşu-sângeriu. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează colonii mici, rotunjite, untoase, nefluide de culoare roşu-închis.4. Teste de identificare a bacteriei Ralstonia solanacearumTestele care permit identificarea izolatelor prezumtive de Ralstonia solanacearum sunt prevăzute în secţiunea VI.B.  +  Secţiunea a III-a 1. Metode detaliate pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici1.1. Pregătirea probeiNOTE:- Mărimea standard a unei probe este de 200 de tuberculi. O procedură mai intensivă de prelevare implică efectuarea de teste pe mai multe probe de această mărime. O probă cu un număr mai mare de tuberculi determină o inhibiţie sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se poate aplica în mod convenabil probelor cu mai puţin de 200 de tuberculi.- Validarea tuturor metodelor de detecţie descrise în continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe probe de 200 de tuberculi.- Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de asemenea, utilizat pentru detecţia prezenţei bacteriei responsabile de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.Opţiuni de pretratare care pot fi efectuate înaintea preparării probei: a) Se incubează proba la 25-30°C până la două săptămâni pentru a favoriza înainte de efectuarea testelor multiplicarea eventualelor populaţii bacteriene de Ralstonia solanacearum. b) Se spală tuberculii. Se utilizează dezinfectanţi (compuşi cloruraţi în cazul în care testul PCR este folosit pentru a îndepărta ADN patogen) şi detergenţi corespunzători între fiecare probă. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru probele cu particule de sol în exces şi în cazul în care se realizează un test PCR sau o procedură de izolare directă.1.1.1. Cu un bisturiu sau un cuţit pentru legume curat şi dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului (punctul de inserţie cu stolonul) fiecărui tubercul, astfel încât să fie vizibil ţesutul vascular. Se taie cu atenţie un miez mic de ţesut vascular (con de ţesut vascular) de la nivelul hilului. Cantitatea de ţesut extravascular trebuie redusă la minimum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).NOTĂ: Se separă tuberculii (în putrefacţie) cu simptome de putregai brun şi se testează separat.În cazul în care, la îndepărtarea conului de ţesut vascular de la nivelul hilului, se observă simptome de putregai brun, trebuie să se realizeze o examinare vizuală a tuberculului respectiv şi o secţionare a acestuia lângă hil. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel puţin două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între 4 şi 10°C) în condiţii de carantină corespunzătoare. Toţi tuberculii, inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstraţi în conformitate cu anexa nr. III.1.1.2. Se colectează conurile în recipiente de unică folosinţă neutilizate care pot fi închise şi/sau sigilate (în cazul în care recipientele sunt refolosite, ele trebuie spălate şi dezinfectate cu compuşi clorinaţi). Este preferabil ca conurile să fie prelucrate imediat. În cazul în care nu este posibil, acestea se depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon, pentru cel mult 72 de ore în frigider şi cel mult 24 de ore la temperatura ambiantă.Se prelucrează conurile prin una dintre următoarele proceduri: a) se acoperă conurile cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (apendicele 4) şi se agită pe un agitator rotativ (50-100 turaţii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau b) conurile se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se mărunţesc într-un sac de macerare de unică folosinţă sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip "Bioreba strong gauge polythene" de 150 mm x 250 mm sterilizat prin radiaţii) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex).NOTĂ: Riscul de contaminare încrucişată a probelor este considerabil în cazul în care probele sunt omogenizate într-un mixer. A se lua măsuri de precauţie pentru a se evita producerea de aerosoli sau scurgeri în timpul procesului de extracţie. A se utiliza palete de mixer şi recipiente sterilizate pentru fiecare probă. La efectuarea testului PCR, se evită transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă măcinarea în saci de unică folosinţă şi utilizarea de tuburi de unică folosinţă.1.1.3. Se decantează supernatantul. În cazul în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de 10 minute, la o temperatură de 4-10°C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 f2μm), spălându-se filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).1.1.4. Bacteriile se concentrează prin centrifugare la 7.000 g timp de 15 minute (sau la 10.000 g timp de 10 minute) la o temperatură de 4-10°C şi se îndepărtează supernatantul fără a deranja sedimentul (extract concentrat).1.1.5. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml tampon concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 f2μl pentru a testa Ralstonia solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus şi 500 f2μl pentru referinţă. Se adaugă glicerol steril la concentraţia finală de 10-25 % (volum) la 500 f2μl de alicote de referinţă şi la alicota de testare rămasă, se omogenizează în vortex şi se depozitează la o temperatură situată între - 16 şi - 24°C (săptămâni) sau între - 68 şi - 86°C (luni). Alicotele de testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de 4-10°C.Nu se recomandă congelările şi decongelările repetate.În cazul în care extractele trebuie transportate, livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen de 24 de ore.1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive de Ralstonia solanacearum şi probele să fie tratate separat pentru a evita orice contaminare. Această condiţie se aplică atât pentru lamele de imunofluorescenţă, cât şi pentru toate testele.1.2. TesteleA se vedea diagrama şi descrierea testelor şi a protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:Izolare selectivă (vezi secţiunea VI.A.4)Testul IF (vezi secţiunea VI.A.5)Testele PCR (vezi secţiunea VI.A.6)Testul FISH (vezi secţiunea VI.A.7)Testele ELISA (vezi secţiunea VI.A.8)Testul biologic (vezi secţiunea VI.A.9)2. Metode detaliate pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de plante de cartof şi plante de tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice2.1. Pregătirea probeiNOTĂ: Pentru detecţia populaţiilor latente de Ralstonia solanacearum, se recomandă testarea unor serii de probe. Procedura poate fi aplicată cu uşurinţă probelor care conţin până la 200 de bucăţi de tulpini. În cazul în care se efectuează supravegheri, acestea trebuie bazate pe o probă reprezentativă din punct de vedere statistic pentru populaţia vegetală în cauză.2.1.1. Se colectează bucăţi de tulpină de 1-2 cm într-un recipient steril închis, în conformitate cu următoarele proceduri de prelevare:Plantule de tomată (răsaduri): cu ajutorul unui cuţit curat şi dezinfectat se taie o bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului.Plante de tomate cultivate în seră sau în câmp: cu ajutorul unui cuţit curat şi dezinfectat se îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante, tăind chiar deasupra joncţiunii cu tulpina principală. Se îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui lăstar lateral.Alte plante-gazdă: cu ajutorul unui cuţit sau al unei foarfeci de grădină curate şi dezinfectate se taie o bucată de 1 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul buruienii Solanum dulcamara sau al altor plante-gazdă care cresc în apă, se taie bucăţi de 1-2 cm din tulpinile care se găsesc sub apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice.În caz de prelevare într-o anumită zonă, se recomandă să se testeze o probă reprezentativă din punct de vedere statistic de cel puţin 10 plante pe punct de prelevare pentru fiecare potenţială buruiană-gazdă. Detecţia agentului patogen se face în modul cel mai fiabil la sfârşitul primăverii, vara şi toamna, deşi infecţiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă. Gazdele cunoscute sunt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara, Solanum nigrum, Datura stramonium şi alte specii din familia Solanaceae. Pelargonium spp. şi Portulaca oleracea sunt, de asemenea, plante-gazdă. Printre anumite buruieni europene care pot găzdui la nivelul rădăcinii şi/sau rizosferei tulpini virulente de Ralstonia solanacearum biovar 2, rasa 3, în condiţii de mediu specifice, se numără Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfarra şi Urtica dioica.NOTĂ: În această etapă se poate efectua examinarea vizuală a simptomelor interne (coloraţie vasculară sau exsudat bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome şi se testează în mod separat (vezi secţiunea II).2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a bucăţilor de tulpină cu etanol de 70% şi se usucă de îndată cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi se prelucrează bucăţile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri: a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (apendicele 4) şi se agită pe un agitator rotativ (50-100 turaţii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 de ore; sau b) bucăţile de tulpină se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un volum corespunzător de tampon de extracţie (apendicele 4), cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucăţile se păstrează, fără a depăşi 72 de ore, la temperatură de refrigerare sau 24 de ore la temperatura ambiantă.2.1.3. Se decantează supernatantul după o sedimentare de 15 minute.2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi realizată prin filtrare şi/sau centrifugare în conformitate cu metoda prevăzută la pct. 1.1.3-1.1.5.2.1.5. Se împarte extractul iniţial sau concentrat în două părţi egale. Se păstrează jumătate la o temperatură de 4-10°C pe parcursul testului şi se conservă cealaltă jumătate cu 10-25 % (volum) glicerol steril la o temperatură situată între - 16 şi - 24°C (săptămâni) sau între - 68 şi - 86°C (luni), în cazul în care este necesar un test suplimentar.2.2. TesteA se vedea diagrama şi descrierea testelor şi protocoalelor optimizate în apendicele corespunzătoare:Izolarea selectivă (vezi secţiunea VI. A.4)Testul IF (vezi secţiunea VI. A.5)Testele PCR (vezi secţiunea VI. A.6)Testul FISH (vezi secţiunea VI. A.7)Testele ELISA (vezi secţiunea VI. A.8)Testul biologic (vezi secţiunea VI. A.9)  +  Secţiunea a IV-a 1. Procedură pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apăPrezentarea diagramei                                  ┌──────────────────────┐                          ┌───────┤ Proba de apa*1) │                          │ └─────────┬────────────┘                          │ └─────────┐                          │ ┌──────────────────┴────────────────┐                          │ │ Concentrarea agentului patogen*2) │                          │ └───────────────────────────────────┘                          └─────────────────┐                  ┌─────────────────────────┴───────────────────────┐                  │ TESTE PRINCIPALE DE SELECTIE │                  │ izolare selectiva*3) │                  │ Teste auxiliare facultative: test biologic*4)/ │                  │ imbogatire PCR*5)/imbogatire ELISA*6) │                  └─────────────────────────┬───────────────────────┘                                            │                                            │            ┌───────────────────────────────┴────────────┐            │ Colonii cu morfologie tipica după izolare*7│            └──────────────────┬─────────────────────────┘                               │                               │ ┌──────┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU*8) ├───┤ R.solanacearum │                               │ └──────┘ │ nedetectat │                             ┌─┴──┐ │proba necontaminata cu│                             │ DA │ │ R.solanacearum │                             └─┬──┘ └──────────────────────┘                               │                   ┌───────────┴───────────────┐                   │ Purificare prin subcultura│                   └───────────┬───────────────┘  ┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐  │TESTE DE IDENTIFICARE*9)├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*10│  └────────────────────────┘ │ └───────────────────────┘              ┌────────────────┴────────────────┐              │ ambele teste confirma o cultura │              │ pura de R.solanacearum │              └────────────────┬────────────────┘                               │ ┌──┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│                               │ └──┘ │ R.solanacearum │                               │ └──────────────────────┘                            ┌──┴─┐                            │ DA │                            └──┬─┘                      ┌────────┴────────────┐                      │proba contaminata cu │                      │ R.solanacearum │                      └─────────────────────┘_________*1) A se vedea secţiunea IV.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.*2) Metodele de concentrare a agentului patogen sunt descrise în secţiunea IV.2.1. Concentrarea sporeşte populaţiile agentului patogen şi ale bacteriilor saprofite concurente şi este recomandată numai în cazul în care nu determină inhibarea testului de izolare.*3) Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI.A.4.*4) Testul biologic este descris în secţiunea VI.A.9.*5) Metodele de îmbogăţire PCR sunt descrise în secţiunile VI.A.4.2 şi VI.A.6.*6) Metodele de îmbogăţire ELISA sunt descrise în secţiunile VI.A.4.2 şi VI.A.8.*7) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II.3.d).*8) Cultivarea riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populaţiile mari de saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după diluarea probei în apă sterilă.*9) Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secţiunea VI.B.*10) Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI.C.2. Metode pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apăPrincipiuProcedura de detecţie validată descrisă în prezenta secţiune se aplică pentru detecţia agentului patogen în probe de apă de suprafaţă şi poate fi folosită, de asemenea, pentru a testa probele de deşeuri lichide provenite din prelucrarea cartofilor sau probele provenite din ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie reţinut faptul că sensibilitatea de detecţie variază în funcţie de substrat. Sensibilitatea testului de izolare este afectată de populaţiile de bacterii saprofite concurente care sunt, în general, mult mai numeroase în probele provenite din prelucrarea cartofilor şi din ape reziduale decât în apele de suprafaţă. În timp ce procedura descrisă în continuare trebuie să detecteze numai 10^3 celule/l în apele de suprafaţă, sensibilitatea de detecţie în deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din acest motiv, se recomandă testarea deşeurilor după eventualele tratamente de purificare (de exemplu, sedimentare sau filtrare) pe parcursul cărora se reduc populaţiile de bacterii saprofite. Limitele sensibilităţii procedurii de testare trebuie avute în vedere atunci când se evaluează fiabilitatea rezultatelor negative obţinute, după caz. Deşi această procedură a fost efectuată cu succes în studiile destinate să stabilească prezenţa sau absenţa agentului patogen în apele de suprafaţă, limitele sale trebuie luate în considerare atunci când este utilizată în lucrări asemănătoare privind deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau apelor reziduale.2.1. Pregătirea probeiNOTE:- Detecţia bacteriei Ralstonia solanacearum în apele de suprafaţă se face în mod mai fiabil la sfârşitul primăverii, vara şi toamna, atunci când temperatura apei este mai mare de 15°C.- Reînceperea prelevării în momente diferite pe parcursul perioadei menţionate anterior în punctele de prelevare desemnate va spori fiabilitatea detecţiei, reducând consecinţele variaţiilor climatice.- Trebuie să se ţină seama de consecinţele ploilor abundente şi de geografia cursului apei pentru a evita efectele de diluare considerabile care pot ascunde prezenţa agentului patogen.- Se prelevă probe de apă de suprafaţă în apropierea plantelor-gazdă în cazul în care aceste plante-gazdă sunt prezente.2.1.1. În punctele de prelevare selecţionate, probele de apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de unică folosinţă la o adâncime, atunci când este posibil, mai mare de 30 cm şi la o distanţă maximă de 2 m de la mal. Pentru deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau pentru apele reziduale, se colectează probe din punctul de deversare a acestora. Mărimea recomandată a probelor poate atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul în care se preferă probe mai mici, se recomandă prelevarea probelor cel puţin în 3 reprize pe punct de prelevare, fiecare probă constând din două subprobe duplicate de cel puţin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se selecţionează cel puţin 3 puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei şi se prelevă şi din afluenţii cursului de apă.2.1.2. Se transportă probele în condiţii de refrigerare (4-10°C) şi la întuneric şi se testează pe parcursul a 24 de ore.2.1.3. La nevoie, probele pot fi concentrate prin una dintre următoarele metode: a) se centrifughează 30-50 ml de subprobă la 10.000 g timp de 10 minute (sau la 7.000 g timp de 15 minute), preferabil la 4-10°C, se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4). b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor, de 0,45 f2μm) urmată de spălarea filtratului în 5-10 ml de tampon concentrat şi reţinerea soluţiilor de spălare. Această metodă este adecvată pentru volume mari de probe de apă, cu conţinut mic de organisme saprofite.În general, concentrarea nu se recomandă pentru probele de deşeuri provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale, dat fiind faptul că populaţiile mai mari de bacterii saprofite concurente vor avea un efect inhibitor asupra detecţiei bacteriei Ralstonia solanacearum.2.2. TesteA se vedea diagrama şi descrierea testelor în apendicii corespunzători.  +  Secţiunea a V-a 1. Procedură pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în solPrezentarea diagramei                                ┌─────────────────────┐                                │ Proba de sol*1) │                                └───────────┬─────────┘                                            │                            ┌───────────────┴──────────────────┐                            │ Extragerea agentului patogen │                            └───────────────┬──────────────────┘                                            │               ┌────────────────────────────┴──────────────────────┐               │ TESTE PRINCIPALE DE SELECTIE │               │ izolare selectiva*2) │               │ Teste auxiliare facultative: imbogatire PCR*3)/ │               │ test biologic*4) │               └────────────────────────────┬──────────────────────┘                                            │                                            │                 ┌──────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐                 │ Colonii cu morfologie│ │ │Toate testele efectuate│                 │ tipica după ├───┴────┤ sunt negative │                 │ izolare*5) │ └───────────────────────┘                 └─────────────┬────────┘                               │                               │ ┌─────┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU*6)├────┤ R.solanacearum │                               │ └─────┘ │ nedetectat │                             ┌─┴──┐ │proba necontaminata cu│                             │ DA │ │ R.solanacearum │                             └─┬──┘ └──────────────────────┘                               │                   ┌───────────┴───────────────┐                   │ Purificare prin subcultura│                   └───────────┬───────────────┘  ┌────────────────────────┐ │ ┌───────────────────────┐  │TESTE DE IDENTIFICARE*7)├───┼─────┤TEST DE PATOGENITATE*8)│  └────────────────────────┘ │ └───────────────────────┘              ┌────────────────┴────────────────┐              │ ambele teste confirma o cultura │              │ pura de R.solanacearum │              └────────────────┬────────────────┘                               │ ┌──┐ ┌──────────────────────┐                               ├──┤NU├────┤proba necontaminata cu│                               │ └──┘ │ R.solanacearum │                               │ └──────────────────────┘                            ┌──┴─┐                            │ DA │                            └──┬─┘                      ┌────────┴────────────┐                      │proba contaminata cu │                      │ R.solanacearum │                      └─────────────────────┘____________*1) A se vedea pct. V.2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.*2) Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI.A.4.*3) Metodele de îmbogăţire PCR sunt descrise în secţiunile VI.A.4.2 şi VI.A.6.*4) Testul biologic este descris în secţiunea VI.A.9.*5) Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II.3.d.*6) Cultivarea riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populaţiile mari de bacterii saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă diluţie a probei.*7) Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secţiunea VI.B.*8) Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI.C.2. Metode pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în solPrincipiiProcedura de detecţie validată descrisă în prezenta secţiune se aplică pentru detecţia agentului patogen în probe de sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa probele de deşeuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu sunt destul de sensibile pentru a garanta detecţia populaţiilor de Ralstonia solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal, care ar putea apărea în probele infectate în mod natural cu aceste substraturi.Limita de sensibilitate a acestei proceduri de testare trebuie avută în vedere la evaluarea fiabilităţii rezultatelor negative obţinute şi, de asemenea, la utilizarea sa în studiile destinate să stabilească prezenţa ori absenţa agentului patogen în soluri sau în nămol. Cel mai fiabil test de detecţie a prezenţei agentului patogen în solul unui câmp este plantarea unei plante-gazdă sensibile şi supravegherea infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă nu va permite detecţia unui nivel slab de contaminare.2.1. Pregătirea probei2.1.1. Prelevarea solului din câmp trebuie să respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se colectează 0,5-1 kg de sol per probă în 60 de puncte, pe o suprafaţă de 0,3 ha, la o adâncime de 10-20 cm (sau dintr-o grilă de 7 x 7 m). În cazul în care se suspectează prezenţa agentului patogen, se măreşte numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafaţă de 0,3 ha. Înainte de testare, probele se păstrează la o temperatură de 12-15°C. Se colectează în total 1 kg de nămol provenit din prelucrarea cartofilor şi nămol de epurare în locurile care reprezintă volumul total de nămol de testat. Înainte de testare, fiecare probă se amestecă bine.2.1.2. Se împart probele în subprobe de 10-25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turaţii/minut) în tampon de extracţie de 60-150 ml (apendice 4) timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20 steril şi 10-20 g de pietriş steril.2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul testului, la 4°C.2.2. TesteA se vedea diagrama şi descrierea testelor în apendicii corespunzători.  +  Secţiunea a VI-a Protocoale optimizate pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearumA. DIAGNOSTIC ŞI TESTE DE DETECŢIE1. Testul eliminării exudatului bacterian din tulpinăPrezenţa bacteriei Ralstonia solanacearum în tulpini ofilite de cartof, tomate sau de alte plante-gazdă poate fi pusă în evidenţă prin următorul test simplu prezumtiv: se secţionează tulpina chiar deasupra nivelului solului. Se suspendă extremitatea tăiată într-un tub cu apă curată. După câteva minute se observă scurgeri spontane şi caracteristice de fire de exudat bacterian din fasciculele vasculare tăiate.2. Detecţia granulelor de poli-f2â-hidroxibutirat1. Se prepară un frotiu din exudatul bacterian scurs din ţesutul infectat pe o lamă de microscop sau se prepară un frotiu dintr-o cultură de 48 de ore de pe mediu YPGA sau SPA (apendice 2).2. Se prepară frotiuri de control pozitiv din culturi de Ralstonia solanacearum biovar 2 şi, în cazul în care se consideră necesar, un frotiu de control negativ cunoscut PHB negativ.3. Se lasă la uscat şi se trece rapid partea inferioară a fiecărei lame de câteva ori prin flacără până la fixarea frotiului.4. Se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil sau negru de Sudan şi se examinează la microscop după cum urmează.Testul cu albastru de Nil a) Fiecare lamă se scufundă într-o soluţie apoasă 1 % de albastru de Nil A şi se incubează 10 minute la 55°C. b) Se scurge soluţia colorantă. Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă. c) Frotiul se scufundă într-o soluţie apoasă de acid acetic de 8 % şi se incubează un minut la temperatura ambiantă. d) Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hârtie absorbantă. e) Se umezeşte cu o picătură de apă şi se aplică o lamelă de acoperire. f) Se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescenţă de 450 nm cu ulei de imersie, la o mărire de 600-1.000, folosindu-se un obiectiv de imersie în ulei sau în apă. g) Se observă fluorescenţa portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la lumină albă pentru a avea certitudinea că granulele sunt intracelulare şi că morfologia celulei este tipică pentru Ralstonia solanacearum.Testul cu negru de Sudan a) Fiecare lamelă se scufundă într-o soluţie de 0,3 % negru de Sudan B în 70 % etanol şi se incubează 10 minute la temperatura ambiantă. b) Se scurge soluţia colorantă şi se spală rapid sub jet de apă. Se îndepărtează excesul de apă cu hârtie absorbantă. c) Lamele se trec rapid prin xilol şi se usucă cu hârtie absorbantă. Atenţie! Xilolul este un produs periculos. Luaţi măsurile de precauţie necesare şi lucraţi într-o hotă chimică. d) Se scufundă lamele în soluţie apoasă de safranină 0,5 % şi se lasă 10 secunde la temperatura ambiantă. Atenţie! Safranina este un produs periculos. Luaţi măsurile de precauţie necesare şi lucraţi într-o hotă chimică. e) Se spală sub jet de apă. Se usucă cu hârtie absorbantă şi se acoperă cu o lamelă. f) Se examinează frotiul colorat la un microscop optic, folosindu-se obiectivul de imersie la o mărire de 1.000. g) Se observă granulele de PHB în celulele de Ralstonia solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana celulară se colorează în roz.3. Teste serologice de aglutinareAglutinarea celulelor de Ralstonia solanacearum în exudatul bacterian sau în extractele de ţesuturi simptomatice se observă cel mai bine folosindu-se anticorpi validaţi (vezi apendice 3) etichetaţi cu markeri coloraţi corespunzători, precum celulele de Staphylococcus aureus roşu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui material disponibil în comerţ (vezi apendice 3), se urmează instrucţiunile producătorului. În caz contrar, se urmează procedura descrisă în continuare: a) Se amestecă picăturile unei suspensii de anticorpi şi de exudat bacterian marcate (circa 5 f2μl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor de testare cu multe godeuri; b) Se prepară suspensii de control pozitiv şi negativ din suspensii de Ralstonia solanacearum biovar 2 şi dintr-o tulpina heterologă; c) Se observă aglutinarea în probele pozitive după o omogenizare uşoară timp de 15 secunde.4. Izolarea pe mediu selectiv4.1. Însămânţare pe mediu selectivNOTĂ: Înainte de aplicarea acestei metode pentru prima dată, se efectuează teste preliminarii pentru a garanta o detecţie reproductibilă a 10^3-10^4 celule formatoare de coloniu (cfu) per ml de Ralstonia solanacearum adăugată la extractele care au dat rezultate negative la testele anterioare.Se foloseşte un mediu selectiv validat corespunzător, de exemplu, SMSA (modificat de Elphinstone et al., 1996; vezi apendicele 2).De asemenea, trebuie diferenţiată Ralstonia solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul respectiv. În plus, coloniile de Ralstonia solanacearum pot prezenta o morfologie atipică în cazul în care plăcile sunt suprapopulate sau în cazul în care sunt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în care se suspectează efectele de concurenţă sau de antagonism, proba trebuie testată din nou, utilizându-se o metodă de testare diferită.Cea mai mare sensibilitate de detecţie, în cadrul acestei metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între - 68 şi - 86°C.Se prepară, pentru control pozitiv, diluţii zecimale de suspensie de 10^6 ufc/ml dintr-o tulpină virulentă biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de probele de testat.Pentru fiecare lot de mediu selectiv proaspăt pregătit, acesta trebuie testat pentru a se vedea dacă este propice înmulţirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină.Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare de însămânţare cu scopul de a asigura diluarea întregii populaţii care formează colonii de saprofite. Se însămânţează 50-100 f2μl din fiecare probă de extract şi fiecare diluţie.4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate şi fluide, iar după 3 zile de incubare dezvoltă o coloraţie roz spre roşu-sângeriu în centru, prezentând spirale sau striaţii interne sau verticile (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).NOTĂ: Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice de Ralstonia solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare roşie şi nefluide sau parţial fluide, fiind, prin urmare, greu de deosebit de bacteriile saprofite care formează colonii.4.1.3. Coloniile prezumtive de Ralstonia solanacearum se purifică după însămânţare şi însămânţare pe mediu nutritiv general pentru a obţine colonii izolate (a se vedea apendicele 2).4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în apă sterilă (pH 6-8, fără clor) la temperatura ambiantă la întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector corespunzător între - 68 şi - 86°C sau liofilizate.4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (vezi secţiunea VI. B) şi se efectuează un test de patogenitate (vezi secţiunea VI. C).Interpretarea rezultatelor testului de izolare pe mediu selectivTestul de însămânţare pe mediu selectiv este negativ atunci când după 6 zile nu sunt observate colonii bacteriene sau atunci când nu sunt observate colonii caracteristice Ralstonia solanacearum, cu condiţia să nu fie suspectată o inhibiţie datorată competiţiei sau antagonismului cu alte bacterii şi în cazul controalelor pozitive să fie observate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum.Testul de însămânţare pe mediu selectiv este pozitiv atunci când sunt observate colonii prezumtive de Ralstonia solanacearum.4.2. Procedura de îmbogăţireA se utiliza un mediu de îmbogăţire validat precum mediul nutritiv modificat Wilbrink (a se vedea apendicele 2).Această procedură poate fi folosită pentru a creşte în mod selectiv populaţiile de Ralstonia solanacearum în probe şi pentru a creşte sensibilitatea detecţiei Procedura permite, de asemenea, diluarea eficientă a inhibitorilor reacţiei PCR (1:100). Cu toate acestea, trebuie notat faptul că îmbogăţirea bacteriei Ralstonia solanacearum poate eşua din cauza concurenţei sau antagonismului organismelor saprofite care sunt de multe ori îmbogăţite simultan. În consecinţă, izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum pe medii nutritive de cultură îmbogăţite poate fi dificilă. De asemenea, întrucât populaţiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se pot înmulţi, în cazul utilizării testului ELISA, se recomandă utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.4.2.1. Îmbogăţirea pentru PCR presupune transferul a 100 f2μl de extract de probă în 10 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogăţire (apendicele 2) alicotat anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogăţirea ELISA, se pot folosi proporţii mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 f2μl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogăţire).4.2.2. Se incubează timp de 72 de ore între 27 şi 30°C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sau PCR.4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de îmbogăţire se tratează în acelaşi mod ca şi probele.NOTĂ: În cazul în care se prevede o inhibiţie a îmbogăţirii bacteriei Ralstonia solanacearum din cauza populaţiilor considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogăţirea extractelor de probe înainte de centrifugare sau alte etape de concentrare pot determina obţinerea unor rezultate mai bune.5. Testul de imunofluorescenţăPrincipiuŢinându-se seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea testului de imunofluorescenţă ca principal test de detecţie rapidă.În cazul în care testul de imunofluorescenţă este utilizat ca principal test detecţie rapidă şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare, un test PCR sau un test FISH drept test secundar. În cazul în care testul de imunofluorescenţă este utilizat ca test secundar şi rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare după cum prevede diagrama funcţională.NOTĂ: Se utilizează o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum. europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai mare diluţie la care se obţine o reacţie optimă atunci când se testează o suspensie de 10^5-10^6 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescenţă de cel puţin 1: 2.000. La efectuarea testului, diluţiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.Testul trebuie efectuat cu extracte de probe proaspăt preparate. După caz, se pot folosi şi extracte conservate în soluţie de glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68°C şi -86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (vezi apendicele 4), recentrifugarea timp de 15 minute la 7.000 g şi resuspendarea în acelaşi volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când probele sunt fixate de lame prin flambare.Separat se prepară lame de control pozitiv dintr-o tulpină omologă sau orice altă tulpină de referinţă de Ralstonia solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede apendicele 3 B, şi, facultativ, în tampon.În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeaşi lamă ţesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între - 16 şi - 24°C).În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de extracte de probe care au dat rezultate negative la testele anterioare de detecţie a bacteriei Ralstonia solanacearum.Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3.Se folosesc pentru microscop lame cu multe godeuri, având, de preferinţă, 10 ferestre cu diametru de cel puţin 6 mm.Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.5.1. Lamele-test se prepară folosindu-se una dintre următoarele metode:(i) Extracte concentrate cu relativ puţin amidon: Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreşte pentru godeuri cu diametru mai mare) dintr-o diluţie de 1/100 de sediment resuspendat în primul godeu. Apoi se pipetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele indicate în figura 1.(îi) Pentru alte extracte concentrate:Se pregătesc diluţii zecimale (1/10, 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se măreşte pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat şi din fiecare diluţie pe un rând de godeuri. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate în figura 2.5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o temperatură de 40-45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă fie prin încălzire (15 minute la 60°C), trecere prin flacără, cu 95 % etanol sau în conformitate cu instrucţiunile specifice ale furnizorilor de antiseruri.În cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi stocate la congelator într-o cutie uscată, atât cât este necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test.5.3. Procedura testului de imunofluorescenţă(i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i):Se prepară un set de diluţii de 1/2. În primul godeu diluţia ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) şi de două ori titrul (2T).(îi) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1(îi):Se prepară diluţia de lucru a anticorpilor în tampon IF.Diluţia de lucru are efect asupra specificităţii.Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) şi 5.3 (i)Diluţii ale extractului concentrat resuspendat    1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluţii ale extractului                           concentrat resuspendat    (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluţii duble ale                           titru) antiserului/anticorpilorFigura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) şi 5.3 (îi)Diluţie de lucru a antiserului/anticorpilor                          Diluţie zecimală a                          sedimentului resuspendat    1/1 1/10 1/100 gol gol5.3.1. Lamele se aşază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluţia sau diluţiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în fiecare godeu trebuie să fie cel puţin echivalent cu volumul de extract pipetat pe lamă.Următoarea procedură ar trebui aplicată în absenţa instrucţiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi:5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).5.3.3. Se îndepărtează antiserul de pe fiecare lamă şi se spală lamele cu atenţie cu tamponul IF. Se spală prin imersare în soluţie tampon IF-Tween (apendice 4) timp de 5 minute şi apoi în tampon IF. Se evită formarea de aerosoli sau transferul de picături care ar putea conduce la o contaminare încrucişată. Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hârtie de filtru.5.3.4. Lamele se aşază pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile lamelor-test cu diluţii ale conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat pipetat în godeuri trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi pipetat.5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25°C).5.3.6. Se îndepărtează conjugatul de pe lamă. Se spală în conformitate cu cele indicate anterior (pct. 5.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de tampon IF.5.3.7. Se pipetează 5-10 f2μl tampon glicerol fosfat 0,1 M (apendicele 4) sau o altă soluţie antidecolorare de montare comercială în fiecare godeu şi se acoperă cu o lamelă.5.4. Citirea testului de imunofluorescenţă5.4.1. Se examinează lamele-test la un microscop cu sursă de lumină epifluorescentă şi cu filtre adaptate pentru a lucra cu izotiocianat de fluoresceină, cu ulei de imersie sau în apă, la o mărire de 500-1.000. Se examinează godeurile pe două diametre în unghi drept şi de-a lungul perimetrului. Pentru probele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel puţin 40 câmpuri microscopice.Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente şi colorate complet la titrul de anticorpi sau la diluţia de lucru determinată. Testul IF (pct. 5) trebuie repetat în cazul în care apare o coloraţie anormală.5.4.2. Se caută prezenţa celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeaşi diluţie de anticorpi. Celulele cu coloraţie incompletă sau cu fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.5.4.3. Există un anumit număr de probleme care afectează specificitatea testului de imunofluorescenţă. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi în bucăţile de tulpini pot apărea populaţii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum şi bacterii saprofite care pot conduce la reacţii încrucişate, având mărime şi morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum.5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune şi morfologie sunt caracteristice titrului sau diluţiei de lucru a anticorpilor menţionaţi la pct. 5.3.5.4.5. Interpretarea testului IF:(i) În cazul în care se observă celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic şi se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 5).Testul de imunofluorescenţă se consideră ca fiind pozitiv pentru probele care conţin cel puţin 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind potenţial contaminată, fiind necesare mai multe testări.(îi) Testul de imunofluorescenţă se consideră ca fiind negativ pentru probele care conţin mai puţin de 5 x 10^3 celule pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind negativă, efectuarea altor teste nefiind obligatorie.6. Testele PCRPrincipiiÎn cazul în care testul PCR se foloseşte drept test principal de detecţie, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test de imunofluorescenţă drept al doilea test de detecţie obligatoriu. În cazul în care testul PCR se foloseşte ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnoza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcţională.O exploatare completă a acestei metode ca test principal de detecţie se recomandă numai atunci când se dobândeşte o expertiză specializată în domeniu.NOTĂ: Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detecţia reproductibilă a 10^3-10^4 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obţine niveluri maxime de sensibilitate şi de specificitate.Se folosesc reactivi şi protocoale PCR validate (vezi apendice 6). Se alege, de preferinţă, o metodă care să conţină un control intern.Se iau măsurile de precauţie necesare pentru a se evita contaminarea probei cu ADN-ţintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentaţi în laboratoare de biologie moleculară specializate, pentru a se reduce cât mai mult posibilitatea contaminării cu ADN-ţintă.Controalele negative (pentru procedurile de extracţie de ADN şi amplificare PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a indica o eventuală apariţie a unui transfer de ADN.Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR:- extractul probei care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea Ralstonia solanacearum;- tampoanele utilizate pentru extracţia ADN din probă;- amestecul de reactivi pentru PCR.Următoarele controale pozitive ar trebui incluse:- alicote de sedimente resuspendate la care s-a adăugat Ralstonia solanacearum (preparare: vezi apendice 3 B);- suspensie de 10^6 celule pe ml dintr-un izolat virulent de Ralstonia solanacearum în apă (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendice 3 B);- atunci când este posibil, se foloseşte, de asemenea, în testul PCR, ADN extras din probe pozitive în testul PCR.Pentru a se evita o eventuală contaminare, controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al probelor de testat.Extractele probelor trebuie curăţate, atât cât este posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci când se prevede utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare extracte de tuberculi de cartofi spălaţi.Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt prevăzute în apendicele 3.6.1. Metode de purificare a ADN-uluiSe folosesc controale pozitive şi negative în conformitate cu metoda descrisă anterior (vezi apendicele 3).Controalele se testează în acelaşi mod cu probele.Există o serie de metode de purificare a ADN-ţintă din substraturile de probe complexe, ce permit eliminarea inhibitorilor PCR şi a altor reacţii enzimatice şi concentrează ADN-ul ţintă din probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6. a) Metoda Pastrik (2000) (1) Se pipetează 220 f2μl de tampon de liză [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml. (2) Se adaugă 100 f2μl de extract de probă şi se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de apă la 95°C timp de 10 minute. (3) Se aşază tubul pe gheaţă timp de 5 minute. (4) Se adaugă 80 f2μl de soluţie concentrată de lizozim (50 mg de lizozim pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) şi se incubează la 37°C timp de 30 de minute. (5) Se adaugă 220 f2μl de soluţie A de Easy DNA(r) (Invitrogen), se amestecă bine prin vortexare şi se incubează la 65°C timp de 30 de minute. (6) Se adaugă 100 f2μl de soluţie B de Easy DNA(r) (Invitrogen), se omogenizează bine prin vortexare până când precipitatul circulă liber în tub, iar proba are o consistenţă uniform-vâscoasă. (7) Se adaugă 500 f2μl de cloroform şi se omogenizează prin vortexare până când vâscozitatea este redusă şi amestecul este omogen. (8) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C pentru a separa fazele şi a forma interfaza. (9) Faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf. (10) Se adaugă 1 ml de etanol 100 % (- 20°C), se omogenizează scurt prin vortexare şi se incubează pe gheaţă timp de 10 minute. (11) Se centrifughează la 15.000 g timp de 20 de minute la 4°C şi se îndepărtează etanolul din extractul concentrat. (12) Se adaugă 500 f2μl de etanol 80 % (- 20°C) şi se amestecă prin răsturnare. (13) Se centrifughează la 15.000 g timp de 10 minute la 4°C, se păstrează sedimentul şi se îndepărtează etanolul. (14) Sedimentul se lasă să se usuce în aer liber sau într-un SpeedVac ADN. (15) Sedimentul se repune în suspensie în 100 f2μl de apă ultrapură sterilă şi se lasă la temperatura ambiantă timp de cel puţin 20 de minute. (16) Se depozitează la - 20°C până când extractul este necesar pentru PCR. (17) Înainte de utilizare se centrifughează, pentru reacţia de amplificare prin PCR fiind necesari 5 f2μl de supernatant conţinând ADN. b) Alte metodePot fi utilizate şi alte metode de extracţie a ADN, de exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit, cu condiţia ca acestea să aibă o eficacitate echivalentă de purificare a ADN-ului din controalele pozitive cu un conţinut de 10^3-10^4 celule patogene per ml.6.2. Amplificare PCR6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN de testat şi controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct. 6). Se prepară o diluţie decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă ultrapură).6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat în conformitate cu protocoalele publicate (apendice 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR multiplex care include un control intern al reacţiei PCR.6.2.3. Se adaugă 2-5 f2μl de extract de ADN pe 25 μl mix PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (vezi apendicele 6).6.2.4. Se include un control negativ conţinând numai mix de amplificare şi se adaugă apă ultrapură, din aceeaşi sursă cu cea utilizată pentru mixul de amplificare PCR, în locul probei.6.2.5. Tuburile se introduc în acelaşi termociclor utilizat la testul preliminar şi se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (apendice 6).6.3. Analiza produsului reacţiei PCR (amplicon)6.3.1. Fragmentele PCR sunt detectate prin electroforeză în gel de agaroză. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puţin 12 f2μl de ADN amplificat din fiecare probă la care se adaugă 3 f2μl de tampon de încărcare (apendice 6) în gel de agaroză 2 % într-un tampon tris-acetat-EDTA (TAE) (vezi apendicele 6). Se foloseşte un marker de ADN corespunzător mărimii aşteptate a ampliconului, precum cel de 100 bp.6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (l0,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luându-se măsurile de precauţie necesare pentru manipularea acestui agent mutagen.6.3.3. În cazul unor produse PCR având mărimea aşteptată (vezi apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (? = 302 nm) şi se notează rezultatele.6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR, efectuându-se o analiză de restricţie enzimatică pe o probă de ADN amplificată rămasă. În acest scop, ADN-ul amplificat rămas se incubează la o temperatură optimă şi pe o perioadă optimă cu o enzimă şi un tampon corespunzător (vezi apendicele 6). Fragmentele restrictate se detectează prin electroforeză în gel de agaroză şi colorare cu bromură de etidiu în conformitate cu metoda descrisă anterior. Dispunerea tipică a fragmentelor după analiza de restricţie enzimatică se vizualizează prin iluminare ultravioletă. Fragmentele de ADN se compară cu tulpinile de control pozitiv înainte şi după restricţie.Interpretarea rezultatului testului PCRTestul PCR este negativ atunci când produsul PCR specific pentru Ralstonia solanacearum cu dimensiunea aşteptată nu este detectat pentru proba respectivă, iar pentru ansamblul de probe, în cazul unui multiplex PCR cu primeri de control intern specific plantei, un al doilea produs PCR cu dimensiunea aşteptată trebuie să fie amplificat cu probele respective.Testul PCR este pozitiv în cazul în care produsul PCR caracteristic de Ralstonia solanacearum de dimensiunea şi tipul de restricţie (atunci când este restrictat) aşteptate este detectat, cu condiţia să nu existe amplificare la probele de control negativ. Se poate obţine o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (apendicele 6).NOTĂ: Se poate suspecta o inhibiţie a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obţinut în cazul controlului pozitiv de Ralstonia solanacearum în apă, dar se obţin rezultate negative în cazul controalelor pozitive conţinând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiţia reacţiei atunci când nu se obţine niciunul dintre cele două fragmente amplificate.Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obţinut din unul sau mai multe controale negative.7. Testul FISHPrincipiuÎn cazul în care testul FISH se foloseşte drept test principal de detecţie şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de detecţie. În cazul în care testul IF se foloseşte ca test secundar şi rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcţională.NOTĂ: Se folosesc oligosonde validate specifice pentru Ralstonia solanacearum (a se vedea apendicele 7). Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecţie reproductibilă de 10^3-10^4 celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative.Este de preferat să se aplice procedura descrisă în continuare extractelor de probe proaspăt preparate, dar se pot folosi şi extracte de probe conservate la temperaturi cuprinse între - 16°C şi - 24°C sau între - 68°C şi - 86°C.Drept control negativ, se folosesc alicote de extracte de probe care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a Ralstonia solanacearum.Drept control pozitiv, se folosesc suspensii conţinând 10^5-10^6 celule pe ml de Ralstonia solanacearum biovar 2 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) preparate în tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Separat, se prepară lame de control pozitiv din tulpina omologă sau din orice altă tulpină de referinţă de Ralstonia solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3 B.Controlul procesului de hibridizare se realizează prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) care colorează toate eubacteriile prezente în probă.Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3 A.Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.7.1. Fixarea extractului de cartofProtocolul descris în continuare se bazează pe Wullings et al. (1998):7.1.1. Se prepară soluţia de fixare (a se vedea apendicele 7).7.1.2. Se pipetează 100 f2μl din fiecare extract de probă într-un tub Eppendorf şi se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g.7.1.3. Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 200 f2μl de soluţie de fixare preparată cu mai puţin de 24 de ore înainte. Se omogenizează prin vortexare şi se incubează timp de o oră în frigider.7.1.4. Se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g, se îndepărtează supranatantul, iar sedimentul se resuspendă în 75 f2μl de PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7).7.1.5. Se pipetează 16 f2μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se pipetează două probe diferite, nediluate, şi 10 f2μl diluţie de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul suspensiei (49 f2μl) poate fi conservată la - 20°C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare şi se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (omogenizaţi prin vortexare).Figura 7.1. Configuraţia unei lame pentru testul FISH7.1.6. Se usucă lamele la temperatura ambiantă (sau într-un uscător, la 37°C), apoi se fixează prin flambare.Procedura de hibridizare poate fi întreruptă în acest stadiu şi continuată a doua zi. Lamele trebuie păstrate într-un loc uscat, la temperatura ambiantă, ferite de praf.7.2. Hibridizare7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol de 50 %, 80 % şi 96 %, cu o durată de un minut fiecare. Se aranjează lamele pe un suport şi se lasă la uscat la temperatura ambiantă.7.2.2. Se realizează o cameră de incubare umedă căptuşind fundul unei cutii ermetice cu hârtie absorbantă sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea apendicele 7). Cutia se preincubează timp de cel puţin 10 minute în incubatorul de hibridizare la o temperatură de 45°C.7.2.3. Se pipetează 10 f2μl de soluţie de hibridizare (apendicele 7) în 8 godeuri (godeuri 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 şi 10; vezi figura 7.1) ale fiecărei lame, lăsând goale cele două godeuri din mijloc (3 şi 8).7.2.4. Se acoperă cu lamele (24 x 24 mm) primul şi ultimele 4 godeuri, având grijă să nu prindă aer sub ele. Lamele se introduc în camera umedă încălzită în prealabil şi se lasă timp de 5 ore în incubator la 45°C la întuneric, pentru hibridizare.7.2.5. Se pregătesc 3 recipiente conţinând 1 l de apă Milli Q (biologie moleculară), 1 l de hibmix 1X în 334 ml de hibmix 3X şi 666 ml de apă Milli Q (biologie moleculară) şi1 l de hibmix 1/8X în 42 ml de hibmix 3X şi 958 ml de apă Milli Q (biologie moleculară). Se preincubează fiecare recipient în baie de apă la 45°C.7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame şi se aşază pe un suport de lame.7.2.7. Se elimină excesul de probă prin incubare timp de 15 minute la 45°C în recipientul cu hibmix 1X.7.2.8. Se transferă suportul cu lame într-o soluţie de spălare cu hibmix 1/8X şi se lasă la incubat timp de încă 15 minute.7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă Milli Q şi se aşază pe o hârtie de filtru. Se îndepărtează umiditatea în exces tamponând uşor suprafaţa umedă cu hârtie de filtru. Se pipetează în fiecare godeu 5-10 f2μl de soluţie antidecolorare (de exemplu, Vectashield produs de Vecta Laboratories CA, USA, sau altă soluţie echivalentă) şi se acoperă întreaga suprafaţă a lamei cu o lamelă (24 x 60 mm).7.3. Citirea testului FISH7.3.1. Lamele se examinează imediat cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă, cu obiectivul de imersie, în ulei de imersie la o mărire de 630 x 1.000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene prezente în probe (inclusiv majoritatea celulelor Gram-negative) apar colorate în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de Ralstonia solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în roşu fluorescent. Se compară morfologia celulelor din probe cu cea a celulelor din controlul pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet şi intens fluorescente. Testul FISH (pct. 7) trebuie repetat în cazul în care apare o coloraţie anormală. Godeurile se examinează de-a lungul a două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu conţin celule sau conţin un număr mic de celule, se examinează cel puţin 40 de câmpuri microscopice.7.3.2. Se observă prezenţa celulelor intens fluorescente, cu o morfologie tipică de Ralstonia solanacearum în ferestrele de test ale lamelor (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv sau mai bună. Celulele cu coloraţie incompletă sau cu fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Aceasta se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau atunci când celulele pozitive se observă în afara godeurilor.7.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente care afectează specificitatea testului FISH. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi tulpinii pot apare populaţii de celule fluorescente cu morfologie atipică şi populaţii de bacterii saprofite care dau reacţii încrucişate, având dimensiuni şi morfologii asemănătoare cu celulele de Ralstonia solanacearum, însă într-o proporţie mult mai mică decât în cazul testului IF.7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente cu dimensiune şi morfologie tipice.7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH:(i) Testul FISH este valid atunci când celulele intens fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni şi morfologie tipice pentru Ralstonia solanacearum, sunt vizibile cu ajutorul filtrului FITC şi celulele intens fluorescente de culoare roşie sunt vizibile folosindu-se filtrul cu rodamină în toate controalele pozitive, iar în controlul negativ nu se observă nicio celulă. În cazul în care proba conţine celule intens fluorescente, cu o morfologie tipică, se estimează numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic şi se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (apendice 4). Probele ce conţin cel puţin 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat se consideră ca fiind potenţial infectate şi se recomandă continuarea testelor. Probele ce conţin mai puţin de 5 x 10^3 celule tipice pe ml de sediment resuspendat sunt considerate ca fiind negative.(îi) Testul FISH este negativ în cazul în care celulele intens fluorescente de culoare roşie, având dimensiuni şi morfologie caracteristice pentru Ralstonia solanacearum, nu se observă cu ajutorul filtrului cu rodamină, cu condiţia ca celulele intens fluorescente de culoare roşie să fie vizibile în lamele de control pozitiv folosindu-se filtrul cu rodamină.8. Testele ELISAPrincipiuTestul ELISA nu poate fi utilizat ca test secundar pe lângă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilităţii sale relativ slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogăţirea probelor şi utilizarea anticorpilor monoclonali sunt obligatorii (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/ Home/main). Îmbogăţirea probelor înainte de efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru creşterea sensibilităţii acestuia, dar poate să inhibe testul din cauza competiţiei cu alte organisme prezente în probă.NOTĂ: Se foloseşte o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai mare diluţie la care se obţine o reacţie optimă atunci când se testează o suspensie de 10^5-10^6 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se conjugate corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu recomandările producătorului. La efectuarea testului, diluţia de lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală cu cea a titrului formulei comerciale.Se determină titrul anticorpilor pentru o suspensie de 10^5-10^6 celule/ml dintr-o tulpină omologă de Ralstonia solanacearum.Drept controale negative se utilizează un extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru Ralstonia solanacearum şi o suspensie bacteriană preparată în tampon fosfat care nu provoacă reacţii încrucişateDrept control pozitiv se folosesc extracte de probe care au dat anterior rezultate negative, la care s-a adăugat 10^3-10^4 celule/ml de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicii 2 A şi B). Pentru a compara rezultatele din fiecare placă se foloseşte o suspensie standard de 10^5-10^6 celule/ml în PBS de Ralstonia solanacearum. Controalele pozitive trebuie să fie pipetate cu grijă pe placa de microtitrare, separat de proba sau probele care fac obiectul testului.Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sunt enumerate în apendicele 3 A.Materialul de control se testează în acelaşi mod cu probele.Au fost validate două protocoale ELISA: a) ELISA indirect (Robinson-Smith et al., 1995) (1) Se folosesc alicote de 100-200 f2μl de sediment resuspendat. (Pentru a reduce rezultatele nespecifice se încălzesc timp de 4 minute la 100°C pe baie de apă sau într-un bloc de încălzire.) (2) Se adaugă un volum egal de tampon 2X (apendicele 4) şi se omogenizează prin vortexare. (3) Se pipetează alicote de 100 f2μl de extract în cel puţin două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) şi se incubează o oră la 37°C sau peste noapte la 4°C. (4) Se îndepărtează extractele din godeuri. Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluţie de spălare în godeuri cel puţin 5 minute. (5) Se prepară diluţia corespunzătoare a antiserului anti-Ralstonia solanacearum în tampon de saturaţie (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validaţi, se folosesc diluţiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul). (6) Se pipetează100 f2μl în fiecare godeu şi se incubează o oră la 37°C. (7) Se îndepărtează soluţia de anticorpi din godeuri şi se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)]. (8) Se prepară diluţia corespunzătoare de conjugat secundar de anticorpi şi de fosfatază alcalină în tampon de saturaţie Se pipetează100 f2μl în fiecare godeu şi se incubează o oră la 37°C. (9) Se îndepărtează conjugatul de anticorpi din godeuri şi se spală în conformitate cu cele indicate anterior [pct. (4)]. (10) Se pipetează 100 f2μl de soluţie de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă şi se măsoară absorbanţa la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. b) DAS-ELISA (1) Se prepară diluţia corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-Ralstonia solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 f2μl în fiecare godeu. Se incubează timp de 4-5 ore la 37°C sau timp de 16 ore la 4°C. (2) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4).Se adaugă 190 f2μl de extract de probă în cel puţin două godeuri. De asemenea, se adaugă controlul pozitiv şi negativ în câte două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de 16 ore la 4°C. (3) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluţie corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici Ralstonia solanacearum în PBS (apendicele 4) conţinând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) şi se pipetează 190 f2μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C. (5) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluţie corespunzătoare de imunoglobuline antişoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 f2μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C. (7) Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluţie de substrat de fosfatază alcalină conţinând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de soluţie tampon (apendicele 4). Se adaugă 200 f2μl în fiecare godeu. Se incubează la întuneric la temperatura ambiantă şi se măsoară absorbanţa la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.Interpretarea rezultatelor testelor ELISATestul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mică decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiţia ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare de 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) şi de două ori mai mare decât densitatea optică obţinută pentru controlul negativ.Testul ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mare decât de două ori densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiţia ca DO pentru toate godeurile de control negativ să fie mai mică decât de două ori DO obţinută pentru godeurile de control pozitiv.O citire negativă a testului ELISA în godeurile de control pozitiv indică faptul că testul nu a fost efectuat corect sau că a fost inhibat. O citire pozitivă a testului ELISA în godeurile de control negativ indică o contaminare încrucişată sau o reacţie nespecifică.9. Testul biologicNOTĂ: Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecţie reproductibilă a 10^3-10^4 celule formatoare de colonii (UFC) per ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative (preparare: vezi apendice 3).Sensibilitatea cea mai mare de detecţie poate fi atinsă atunci când se folosesc extracte de probe proaspăt preparate şi în condiţii optime de creştere. Cu toate acestea, metoda se poate aplica cu succes extractelor păstrate în glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68 şi - 86°C.Următorul protocol se bazează pe protocolul Janse (1988):9.1. Pentru fiecare probă se utilizează 10 plante-test ale unui soi (cultivar) de tomate sensibil (de exemplu, Moneymaker sau un cultivar cu o sensibilitate echivalentă stabilită în laboratorul de testare) în stadiul celei de-a treia frunze adevărate. Pentru detalii privind cultura, vezi apendicele 8. De asemenea, se pot utiliza vinete (de exemplu, Black Beauty sau cultivări cu o sensibilitate echivalentă), folosindu-se numai plante în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Cu toate acestea, s-a constatat că la plantele de vinete simptomele sunt mai puţin severe şi se dezvoltă mai încet. Prin urmare, atunci când este posibil, se recomandă utilizarea plantulelor de tomate.9.2. Se inoculează 100 f2μl de extract în fiecare plantă-test.9.2.1. Inoculare prin injectarePlantele-test se inoculează în tulpină chiar deasupra cotiledoanelor cu ajutorul unei seringi cu ac hipodermic (minimum 23G).9.2.2. Inoculare prin incizieSe ţine planta între două degete şi se pipetează pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză, o picătură (circa 5-10 f2μl) de extract de probă.Cu ajutorul unui bisturiu steril, plecând de la picătura de extract, se face o incizie diagonală pe o lungime de 1 cm şi cu o adâncime egală cu aproximativ două treimi din grosimea tulpinii.Se închide incizia aplicând vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi.9.3. Prin aceeaşi tehnică se inoculează 5 plantule cu o suspensie apoasă de 10^5-10^6 celule per ml dintr-o cultură virulentă de 48 de ore de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv şi 5 plantule cu tampon fosfat (apendice 4) drept control negativ. Se separă plantele control pozitiv şi negativ de celelalte plante pentru a se evita contaminările încrucişate.9.4. Plantele test se cresc în încăperi de carantină până la 4 săptămâni la temperatura de 25-30°C şi umiditate relativ mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a se evita contaminarea, plantele control pozitiv şi negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori cameră de cultivare sau, în cazul în care spaţiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele aparţinând unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precauţie pentru a se evita o contaminare încrucişată. Este esenţial ca în serele şi camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.Se observă apariţia simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză şi/sau pipernicire.9.5. Se izolează plantele infectate şi se identifică culturile purificate prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum (lit. B).9.6. În cazul în care nu se observă niciun simptom după 3 săptămâni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare pe o probă formată din bucăţi de tulpină de 1 cm prelevate de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează însămânţarea pe mediu de cultură (pct. 4.1).9.7. Se identifică toate culturile purificate prezumtive de Ralstonia solanacearum (lit. B).Interpretarea rezultatelor testului biologic:Rezultatele testului biologic sunt valide atunci când plantele control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi reizolate din aceste plante şi nu se observă niciun simptom la plantele control negativ.Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test inoculate cu extract de probă nu sunt infectate cu Ralstonia solanacearum şi cu condiţia ca Ralstonia solanacearum să fie detectată în plantele control pozitiv.Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum.B. TESTE DE IDENTIFICARECulturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se identifică prin cel puţin unul dintre următoarele teste bazate pe principii biologice diferite.Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute, pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).1. Teste de identificare enzimatice şi de nutriţieSe stabilesc următoarele caracteristici fenotipice prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în conformitate cu metodele descrise de Lelliott şi Stead (1987), Klement et al. (1990) şi Schaad (2001).
         
      TestRezultat preconizat
      Producţia de pigmenţi fluorescenţi-
      Incluziuni de poli-beta-hidroxibutirat+
      Test de oxidare/fermentare (O/F)O+/F-
      Activitatea catalazei+
      Testul oxidazei de Kovac+
      Reducerea nitratului+
      Utilizarea citratului+
      Creştere la 40°C-
      Creştere în 1% NaCl+
      Creştere în 2% NaCl-
      Activitatea arginin dihidrolazei-
      Lichefierea gelatinei-
      Hidroliza amidonului-
      Hidroliza esculinei-
      Producţie de levan-
    2. Testul IF2.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în tampon IF (apendice 4).2.2. Se prepară o serie de diluţii de 1/2 dintr-un antiser corespunzător (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/ irc/sanco/Home/main).2.3. Se aplică procedura testului IF (lit. A pct. 5).2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obţinut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv.3. Testul ELISANOTĂ: În cazul în care se efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează alte teste serologice pe lângă această metodă.3.1. Se prepară o suspensie de circa 10^8 celule/ml în PBS 1X (vezi apendicele 4).3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică a culturii este egală cel puţin cu 1/2 din densitatea optică obţinută pentru controlul pozitiv.4. Testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)4.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă sterilă ultrapură.4.2. Se pipetează 100 f2μl din suspensie în tuburi închise şi se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o temperatură situată între - 16 şi - 24°C până în momentul în care sunt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik amp; Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia solanacearum se obţine atunci când fragmentele amplificate prin PCR au aceeaşi dimensiune şi aceleaşi polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricţie cu cele ale tulpinii de control pozitiv.5. Testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)5.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă ultrapură.5.2. Se aplică procedura FISH (lit. A pct. 7) folosindu-se cel puţin două oligosonde specifice pentru Ralstonia solanacearum (apendice 7).5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura trebuie să prezinte aceleaşi reacţii ca şi controlul pozitiv.6. Profilul acizilor graşi (FAP)6.1. Se realizează o cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. Prezenţa acizilor graşi caracteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH şi 18:1 2OH şi absenţa16:0 3OH indică prezenţa Ralstonia sp.7. Metode de caracterizare a tulpiniiSe recomandă o caracterizare a tulpinii prin una dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia solanacearum.Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).7.1. Determinarea biovaruluiExistă diferite biovaruri de Ralstonia solanacearum în funcţie de capacitatea lor de a utiliza şi/sau oxida 3 zaharuri şi 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 şi Hayward et al., 1990). Mediile de creştere pentru testul biovarului sunt descrise în apendicele 2. Testul poate fi realizat inoculând prin injectare profundă a mediilor cu culturi pure de izolat de Ralstonia solanacearum şi incubare la 28°C. În cazul în care mediile sunt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri sterile (200 f2μl/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72 de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al testului.
                 
        Biovar
      12345
      Utilizarea:          
      Maltozei-++-+
      Lactozei-++-+
      D (+) Celobiozei-++-+
      Manitolului--+++
      Sorbitolului--++-
      Dulcitolului--++-
        Teste suplimentare diferenţiază biovarul 2 în subfenotipuri:
             
        Biovar 2A (răspândit în lume)Biovar 2A (găsit în Chile şi în Columbia)Biovar 2T (găsit în zona tropicală)
      Utilizarea trehalozei-++
      Utilizarea mezo-inozitei+-+
      Utilizarea D-ribozei--+
      Activitate pectolitică1)scăzutăscăzutăridicată
      1) Vezi Lelliott Stead (1987)
    7.2. Amprentare genomicăDiferenţierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin:7.2.1. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie (RFLP) (Cook et al., 1989);7.2.2. PCR realizat pe secvenţe repetitive folosindu-se primeri REP, BOX şi ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995);7.2.3. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie amplificate (Van der Wolf et al., 1998).7.3. metodele PCR.Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; vezi apendice 6) pentru a diferenţia tulpinile aparţinând diviziunii 1 (biovari 3, 4 şi 5) şi diviziunii 2 (biovari 1, 2A şi 2T) ale Ralstonia solanacearum, definite iniţial de analiza RFLP (Cook et al., 1989) şi analiza secvenţei 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).C. TEST DE CONFIRMARETestul de patogenitate trebuie efectuat pentru confirmarea finală a diagnosticului şi pentru evaluarea virulenţei culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum. (1) Se prepară un inoculum de circa 10^6 celule/ml dintr-o cultură de 24-48 de ore dintr-o tulpină corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicele 3). (2) Se inoculează 5-10 plantule de tomate sau vinete sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (vezi lit. A pct. 9). (3) Se incubează până la două săptămâni la 25-28°C şi umiditate relativă crescută, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absenţa simptomelor la sfârşitul acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Ralstonia solanacearum. (4) Se observă apariţia simptomelor de ofilire şi/sau epinastie, cloroză şi de pipernicire. (5) Se izolează plantele simptomatice îndepărtând o secţiune de ţesut din tulpină la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunţeşte şi se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM (apendice 4). Se însămânţează suspensia pe un mediu adecvat, de preferinţă mediu selectiv (apendice 2), se incubează timp de 48-72 de ore la 28°C şi se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum.Apendicele 1Laboratoarele care efectuează optimizarea şi validarea protocoalelor
           
      Laborator1)OraşŢara
      Agentur fur Gesundheit und ErnahrungssicherheitViena şi LinzAustria
      Departament GewasbeschermingMerelbekeBelgia
      PlantedirektoratetLyngbyDanemarca
      Central Science LaboratoryYorkAnglia
      Scottish Agricultural Science AgencyEdinburghScoţia
      Laboratoire national de la protection des vegetaux, Unite de BacteriologieAngersFranţa
      Laboratoire national de la protection des vegetaux, Station de quarantine de la pomme de terreLe RheuFranţa
      Biologische BundesanstaltKleinmachnowGermania
      Pflanzenschutzamt HannoverHanovraGermania
      State LaboratoryDublinIrlanda
      Dipartimento di Scienze e Tecnologie AgroambientaliBolognaItalia
      Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi FitosanitariVeronaItalia
      Nederlandse Algemene KeuringesdienstEmmeloordŢările de Jos
      Plantenziektenkundige DienstWageningenŢările de Jos
      Direccao-Geral de Proteccao das CulturasLisabonaPortugalia
      Centro de Diagnostico de AldearrubiaSalamancaSpania
      Instituto Valenciano de Investigaciones AgrariasValenciaSpania
      Swedish University of Agricultural SciencesUppsalaSuedia
      1) Experţi de contact: vezi http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
    Apendicele 2Medii pentru izolarea şi cultivarea bacteriei Ralstonia solanacearum a) Medii de creştere în general
         
      Agar nutritiv (AN)  
      Agar nutritiv (Difco)23,0 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
         
      Drojdie - peptonă - glucoză-agar (YPGA)  
      Extract de levură (Difco)5,0 g
      Bacto-peptonă (Difco)5,0 g
      D (+) glucoză (monohidrat)10,0 g
      Bacto-agar (Difco)15,0 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
         
      Zaharoză - peptonă - agar (SPA)  
      Zaharoză20,0 g
      Bacto-peptonă (Difco)5,0 g
      K2HPO40,5 g
      MgSO4▪7H2O0,25 g
      Bacto-geloză (Difco)15,0 g
      Apă distilată1,0 l
      pH 7,2-7,4
    Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
         
      Mediul tetrazoliu Kelman  
      Acizi casiminici (Difco)1,0 g
      Bacto-peptonă (Difco)10,0 g
      Dextroză5,0 g
      Bacto-agar (Difco)15,0 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.Se răceşte la 50°C şi se adaugă o soluţie apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obţinerea unei concentraţii finale de 50 mg la litru. b) Medii de creştere selective validate
         
      Mediu SMSA (Englebrecht, 1994, modificat de Elphinstone et al., 1996)
      Mediu de bază
      Acizi casiminici (Difco)1,0 g
      Bacto-peptonă (Difco)10,0 g
      Glicerol5,0 ml
      Bacto-agar (Difco) (vezi nota 2)15,0 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.Se răceşte la 50°C şi se adaugă soluţii apoase concentrate, sterilizate prin filtrare, conţinând următoarele ingrediente pentru obţinerea concentraţiilor finale specificate:
         
      Cristal violet (Sigma)5 mg la litru
      Sulfat de polimixină B (Sigma P-1004)600.000 unităţi (circa 100 mg) la litru
      Bacitracină (Sigma B-0125)1.250 unităţi (circa 25 mg) la litru
      Cloramfenicol (Sigma C-3175)5 mg la litru
      Penicilină-G (Sigma P-3032)825 unităţi (circa 0,5 mg) la litru
      Clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma)50 mg la litru
    Observaţii:1. Utilizarea altor reactivi decât cei menţionaţi anterior poate afecta creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.2. Agarul de tip oxoid nr. 1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz, creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar şi creşterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea, redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum poate dura o zi sau două în plus, iar coloraţia roşie poate fi mai puţin pronunţată decât pe mediu de Bacto-agar.3. O creştere a concentraţiei de bacitracină la 2.500 de unităţi la litru poate reduce populaţiile de bacterii concurente fără a perturba creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.Mediile şi soluţiile concentrate de antibiotice se păstrează la 4°C la întuneric şi timp de maximum o lună.Trebuie asigurată absenţa condensului pe suprafaţa plăcilor înainte de utilizare.A se evita uscarea excesivă a plăcilor.După prepararea fiecărui lot nou de mediu de cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însămânţarea unei suspensii dintr-o cultură de referinţă de Ralstonia solanacearum (vezi apendicele 3) şi se observă formarea de colonii tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile. c) Medii de îmbogăţire validateMediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996)Se prepară ca şi pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină Bacto-agar şi clorura de 2-3-5-tetrazoliu.
         
      Mediu nutritiv modificat Wilbrink (Caruso et al., 2002)
      Zaharoză10 g
      Proteoză peptonă5 g
      K2HPO40,5 g
      MgSO40,25 g
      NaNO30,25 g
      Apă distilată1 l
    Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute şi se răceşte la 50°C.Se adaugă soluţii concentrate de antibiotice ca şi pentru mediul nutritiv SMSA.Apendicele 3A. Material de control standardizat disponibil în comerţ a) Tulpini bacterieneUrmătoarele tulpini bacteriene se recomandă spre utilizare în calitate de material standard de referinţă sau control pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita reacţiile încrucişate (tabelul 2). Toate tulpinile sunt disponibile în comerţ la următoarele adrese:1. Naţional Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Ţările de Jos;3. Collection francaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA - Station de phytobacteriologie, Angers, Franţa.Tabelul 1. Tulpini de referinţă SMT de Ralstonia solanacearum
               
      Cod NCPPBSMT diezAlte coduriŢara de origineBiovar
      NCPPB 41536CFBP 4582, Pr 3020, EURS 11Egipt2
      NCPPB 415410CFBP 4585, 550, EURS 21Turcia2
      NCPPB 385712CFBP 4587, Pr 1140, EURS 26Anglia2
      NCPPB158423CFBP 4598, EURS 49Cipru2
      NCPPB 250524CFBP 4599, EURS 50Suedia2
      NCPPB 415526CFBP 4601,502, EURS 55Belgia2
      NCPPB 4156(*)71 (*)PD 2762, CFBP 3857Ţările de Jos2
      NCPPB 415766LNPV 15,59Franţa2
      NCPPB 415839CFBP 4608, Port448, EURS 80, NCPPB 4066Portugalia2
      NCPPB 416069IVIA-1632-2Spania2
      NCPPB 416176B3BGermania2
      NCPPB 32541CFBP 2047, KEL 60-1, R 842Statele Unite1
      NCPPB 396742CFBP 4610, R285, GONg7Costa Rica1
      NCPPB 402843CFBP 4611, R303/571, CIP 310, SEQ 205Columbia2
      NCPPB 398544CFBP 4612, R 578, CIP 312Peru2T
      NCPPB 398945CFBP 4613, R 568, CIP 226Brazilia2T
      NCPPB 399646CFBP 3928, R 276/355, CIP 72, SEQ 225Peru3
      NCPPB 399747CFBP 4614, R 280/363, CIP 49, HAY 0131aAustralia3
      NCPPB 402948CFBP 4615, R 297/ 349, CIP 121, CMIb 2861Sri Lanka4
      NCPPB 400549CFBP 4616, R470Filipine4
      NCPPB 401150CFBP 4617, R288, Hemps 2China5
    _______ Notă *) A se utiliza ca tulpină de referinţă standard biovarul 2 rasa 3 de Ralstonia solanacearum.NOTĂ: Autenticitatea tulpinilor menţionate anterior poate fi garantată numai în cazul în care acestea sunt obţinute dintr-o colecţie de culturi autentice.Tabelul 2. Tulpini de referinţă SMT corelate serologic sau genetic în vederea utilizării pentru optimizarea testelor de detecţie
             
      Cod NCPPBSMT diezAlt codIdentificare
      NCPPB 416251CFBP 1954Bacillus polymyxa1)
      NCPPB 416352CFBP 1538Pseudomonas marginalis pv. Marginalis1)
      NCPPB 4164-CFBP 2227Burkholderia cepacia2)
      NCPPB 4165-CFBP 2459Ralstonia pickettii2)
      NCPPB 416658CFBP 3567 CSL Pr 1150Ralstonia pickettii1)
      NCPPB 416760CFBP 4618 PD 2778Ralstonia sp1)
      NCPPB 112753CFBP3575Burkholderia andropogonis1)
      NCPPB 35354CFBP 3572Burkholderia caryophylli1)
      NCPPB 94555CFBP 3569Burkholderia cepacia1)
      NCPPB 370856CFBP 3574Burkholderia glumae1)
      NCPPB 359057CFBP 3573Burkholderia plantarii1)
      NCPPB 372659CFBP 3568Banana Blood Disease Bacterium1),2), 3)
      NCPPB 416861CFBP 4619 IPO S339Enterobacter sp1)
      NCPPB 416962IPO 1695Enterobacter sp1)
      NCPPB417063CFBP 4621 IPO S306Ochrobactrum anthropi1), 2)
      NCPPB 417164CFBP 4622 IPO 1693Curtobacterium sp1),2)
      NCPPB 417265IPO 1696aPseudomonas sp1)
      NCPPB 4173-PD 2318Aureobacteriu sp2)
      NCPPB 417481IVIA 1844.06Flavobacterium sp.1),2)
    _________ 1) Tulpină care poate determina în testele serologice (IF şi/sau ELISA) o reacţie încrucişată cu antiserurile policlonale. 2) Tulpină din care poate fi amplificat produsul PCR în anumite laboratoare, având dimensiuni asemănătoare celor preconizate la utilizarea primerilor specifici OLI-1 şi Y-2 (vezi apendicele 6). 3) Poate determina o reacţie încrucişată în majoritatea testelor, dar cunoscut ca fiind prezent numai pe banan în Indonezia. b) Material de control standardizat disponibil în comerţUrmătorul material de control standardizat este disponibil în colecţia de culturi NCPPB:- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartof sănătoşi în calitate de control negativ pentru ansamblul testelor;- granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartofi sănătoşi conţinând 10^3-10^4 şi 10^4-10^6 celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele serologice şi testul PCR. Întrucât liofilizarea afectează viabilitatea celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de izolare sau testele biologice;- suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentraţie 10^6 celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.B. Pregătirea controalelor pozitive şi negative pentru testele rapide de detecţie PCR/ F şi FISH efectuate pe conuri de cartofSe realizează o cultură de 48 de ore dintr-o tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSA şi se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obţine o densitate celulară de circa 2 x 10^8 ufc/ml. În general, aceasta se obţine printr-o suspensie uşor tulbure echivalentă cu o densitate optică de 0,15-600 nm.Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof, varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia solanacearum.Conurile se tratează după metoda obişnuită şi se resuspendă sedimentul în 10 ml.Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900 f2μl de sediment resuspendat.Se transferă 100 f2μl din suspensia de Ralstonia solanacearum în prima microfiolă şi se omogenizează prin vortexare.Se realizează diluţii zecimale în următoarele 5 microfiole.Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.Se prepară alicote de 100 f2μl în microfiole sterile de 1,5 ml pentru a obţine 9 replici din fiecare control. Se conservă la - 16 şi - 24°C până la utilizare.Prezenţa şi concentraţia de celule de Ralstonia solanacearum în control trebuie confirmate în primul rând prin IF.Pentru testul PCR, se efectuează o extracţie de ADN din controale pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.Pentru testele IF şi FISH, se efectuează teste asupra controalelor pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.Pentru testele IF şi FISH, nivelul de detecţie al celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel puţin 10^6 şi 10^4 celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ să nu fie detectate.Apendicele 4Tampoane pentru procedura de testareGeneralităţi: tampoanele sterilizate nedeschise pot fi păstrate până la un an.1. Soluţii-tampon pentru procedura de extracţie1.1. Tampon de extracţie (50 mM tampon fosfat, pH 7,0)Acest tampon este utilizat pentru extracţia bacteriei din ţesuturile plantei prin omogenizare sau agitare.
         
      Na2HPO44,26 g
      KH2PO42,72 g
      Apă distilată1, 00 l
    Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.Utilizarea următorilor compuşi suplimentari poate fi utilă:
           
        UtilizareCantitate (la l)
      Fulgi de LubrolPeptizant(*)0,5 g
      Silicon antispumant DCAgent antispumant(*)1,0 ml
      Pirofosfat tetrasodicAntioxidant1,0 g
      Polivinilpirolidonă-40000 (PVP-40)Legarea inhibitorilor PCR50 g
    _________(*) A se utiliza cu metoda de extracţie prin omogenizare.1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat, pH 7,2)Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a concentrării prin centrifugare.
         
      Na2HPO4 ▪ 12H2O2,7 g
      NaH2PO4 ▪ 2H2O0,4 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.2. Soluţii-tampon pentru testul de imunofluorescenţă2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2Acest tampon este utilizat pentru diluţia anticorpilor.
         
      Na2HPO4 ▪ 12H2O2,7 g
      NaH2PO4 ▪ 2H2O0,4 g
      NaCl8,0 g
      Apă distilată1,0 l
    Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.2.2. Tampon IF-TweenAcest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor.Se adaugă 0,1 % Tween 20 la tamponul IF.2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru mărirea fluorescenţei.
         
      Na2HPO4 ▪ 12H2O3,2 g
      NaH2PO4 ▪ 2H2O0,15 g
      Glicerol50 ml
      Apă distilată100 ml
    În comerţ sunt disponibile soluţii-suport antidecolorare, de exemplu, Vectashield(R) (Vector Laboratories) sau Citifluor(R) (Leica).3. Soluţii tampon pentru testul ELISA indirect3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6
         
      Na2CO36,36 g
      NaHCO311,72 g
      Apă distilată1,00 l
    Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2 %) ca antioxidant pentru a împiedica constituirea de compuşi aromatici oxidaţi.3.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4
         
      NaCl80,0 g
      KH2PO42,0 g
      Na2HPO4 ▪ 12H2O29,0 g
      KCl2,0 g
      Apă distilată1,0 l
    3.3. PBS-Tween
         
      10 x PBS100 ml
      10% Tween 205 ml
      Apă distilată895 ml
    3.4. Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat proaspăt)
         
      10 x PBS10,0 ml
      Polivinilpirolidonă-44000 (PVP-44)2,0 g
      10% Tween 200,5 ml
      Lapte praf0,5 g
      Apă distilatăpână la 100 ml
    3.5. Soluţie de substrat de fosfatază alcalină, pH 9,8
         
      Dietanolamină97 ml
      Apă distilată800 ml
    Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.Se adaugă apă distilată până la 1 litru.Se adaugă 0,2 g MgCl(2).Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de fosfatază (Sigma) la 15 ml de soluţie.4. Tampoane pentru testul DASI ELISA4.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6
         
      Na2CO31,59 g
      NaHCO32,93 g
      Apă distilată1.000 ml
    Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul.4.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4
         
      NaCl80,0 g
      NaH2PO4 ▪ 2H2O4,0 g
      Na2HPO4 ▪ 12H2O27,0 g
      Apă distilată1.000 ml
    4.3. PBS-Tween
         
      10 x PBS50 ml
      10% Tween 205 ml
      Apă distilată950 ml
    4.4. Tampon de substrat, pH 9,8
         
      Dietanolamină100 ml
      Apă distilată900 ml
    Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.Apendicele 5Stabilirea gradului de contaminare în testele IF şi FISH1. Se calculează numărul mediu de celule fluorescente tipice pe câmp (c).2. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeul lamei de microscop (C).
         
      C = c x S/s, unde:S = suprafaţa (S) a godeului lamei cu multe godeuri, şi
        s = suprafaţa (s) câmpului obiectivului
      s = PI i2/4G2K2, unde:i = coeficientul de câmp (depinde de tipul ocularului şi variază de la 8 la 24)
        K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)
        G = grosisment (de 100 de ori, 40 de ori etc.) obiectiv.
    3. Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe ml de sediment resuspendat (N).    N = C x 1.000/y x F,    unde: y = volumul de extract concentrat resuspendat    şi per godeu,                              F = factorul de diluţie al sedimentului                                  resuspendatApendicele 6Protocoale PCR şi reactivi validaţiNOTĂ: Testele preliminare trebuie să permită detecţia reproductibilă a 10^3-10^4 celule de Ralstonia solanacearum pe ml de extract de probăDe asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o gamă de tulpini bacteriene selecţionate (vezi apendicele 3).1. Protocolul PCR Seal et al. (1993)1.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor
         
      Primer sens OLI-15'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
      Primer antisens Y-25'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'
    Dimensiunea prevăzută a ampliconului de ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp1.2. Amestecul reactiv pentru PCR
           
      ReactivCantitate per reacţieConcentraţie finală
      Apă ultrapură sterilă17,65 μl  
      Tampon PCR x 101 (15 mM MgCl2)2,5 μl1 x (1,5 mM MgCl2)
      Amestec dNTP (20 mM)0,25 μl0,2 mM
      Primer OLI-1 (20 μM)1,25 μl1 μM
      Primer Y-2 (20 μM)1,25 μl1 μM
      Polimerază Taq (5 U/μl)10,1 μl0,5 U
      Volumul de ADN extras din probă2,0 μl  
      Volum total25 μl  
    _______ 1) Metoda a fost validată cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.1.3. Condiţiile reacţiei PCRSe urmează procedura:
           
      1 ciclu de:(i)2 minute la 96°C: denaturarea matriţei ADN
      35 cicluri de:(ii)20 secunde la 94°C: denaturarea matriţei ADN
        (iii)20 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri
        (iv)30 secunde la 72°C: extinderea ADN
      1 ciclu de:(v)10 minute la 72°C (extinderea finală)
        (vi)Se menţine la 4°C.
    NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.1.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconuluiFragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 37°C cu enzima Ava II.2. Protocolul PCR Pastrik amp; Maiss (2000)2.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor
         
      Primer sens Ps-15'-AGT CGA ACG GCA GCG GGG G-3'
      Primer antisens Ps-25'-GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA-3'
    Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ului-ţintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.2.2. Amestecul reactiv pentru PCR
           
      ReactivCantitate per reacţieConcentraţie finală
      Apă ultrapură sterilă16,025 μl  
      Tampon PCR x 1012,5 μl1 x (1,5 mM MgCl2)
      BSA (fracţiune V) (10%)0,25 μl0,1%
      Amestec dNTP (20 mM)0,125 μl0,1 mM
      Primer Ps-1 (10 μM)0,5 μl0,2 μM
      Primer Ps-2 (10 μM)0,5 μl0,2 μM
      Polimerază Taq (5 U/μl)10,1 μl0,5 U
      Volumul de ADN extras din probă5,0 μl  
      Volum total25,0 μl
    ________ 1) Metodele au fost validate cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.NOTĂ: Optimizată iniţial pentru termociclorul MJ Research PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.AmpliTaq de PerkinElmer şi tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleaşi concentraţii.2.3. Condiţiile reacţiei PCRSe urmează procedura:
           
      1 ciclu de:(i)5 minute la 95°C: denaturarea matriţei ADN
      35 cicluri de:(ii)30 secunde la 95°C: denaturarea matriţei ADN
        (iii)30 secunde la 68°C: hibridizare cu primeri
        (iv)45 secunde la 72°C: extinderea ADN
      1 ciclu de:(v)5 minute la 72°C (extinderea finală)
        (vi)Se menţine la 4°C.
    NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.2.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconuluiProdusele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricţie obţinute din fragmentul specific de ADN de Ralstonia solanacearum au o lungime de 457 bp şi de 96 bp.3. Protocolul multiplex PCR şi cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002)3.1. Secvenţa de primer de oligonucleotide
         
      Primer sens Rs-1-F5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
      Primer antisens Rs-1-R5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
      Primer sens Ns-5-F5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
      Primer antisens Ns-6-R5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
    Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezenţa setului de primeri Rs)Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezenţa setului de primeri Ns)3.2. Amestecul reactiv pentru PCR
           
      ReactivCantitate per reacţieConcentraţie finală
      Apă ultrapură sterilă12,625 μl  
      Tampon PCR x 101 (1,5 mM MgCl2)2,5 μl1 x (1,5 mM MgCl2)
      BSA (fracţiune V) (10%)0,25 μl0,1%
      Amestec dNTP (20 mM)0,125 μl0,1 mM
      Primer Rs-1-F (10 μM)2,0 μl0,8 μM
      Primer Rs-1-R (10 μM)2,0 μl0,8 μM
      Primer Ns-5-F (10 μM)20,15 μl0,06 μM
      Primer Ns-6-R (10 μM)20,15 μl0,06 μM
      Polimerază Taq (5 U/μl)10,2 μl1,0 U
      Volumul de ADN extras din probă5,0 μl  
      Volum total25,0 μl
    _________ 1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL. 2) Concentraţiile primerilor Ns-5-F şi Ns-6-R au fost optimizate pentru extracţia conurilor de cartof, utilizându-se metoda de omogenizare şi pentru metoda de izolare a ADN Pastrik (2000) (vezi secţiunea VI. A.6.1.a). Va fi nevoie de o nouă optimizare a concentraţiilor de reactivi în cazul în care se aplică extracţia prin agitare şi se folosesc alte metode de izolare de ADN.3.3. Condiţiile reacţiei PCRSe urmează procedura:
           
      1 ciclu de:(i)5 minute la 95°C: denaturarea matriţei ADN
      35 cicluri de:(ii)30 secunde la 95°C: denaturarea matriţei ADN
        (iii)30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri
        (iv)45 secunde la 72°C: extinderea ADN
      1 ciclu de:(v)5 minute la 72°C (extinderea finală)
        (vi)Se menţine la 4°C.
    NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.3.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconuluiProdusele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute.4. Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia solanacearum (Pastrik et al., 2001)4.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor
         
      Primer sens Rs-1-F5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
      Primer antisens Rs-1-R5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
      Primer antisens Rs-3-R5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
    Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum:cu Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bpcu Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.4.2. Amestecul reactiv pentru PCR a) PCR specific biovarului 1/2
           
      ReactivCantitate per reacţieConcentraţie finală
      Apă ultrapură sterilă12,925 μl  
      Tampon PCR x 1012,5 μl1 x (1,5 mM MgCl2)
      BSA (fracţiune V) (10%)0,25 μl0,1%
      Amestec dNTP (20 mM)0,125 μl0,1 mM
      Primer Rs-1-F (10 μM)2 μl0,8 μM
      Primer Rs-1-R (10 μM)2 μl0,8 μM
      Polimerază Taq (5 U/μl)10,2 μl1 U
      Volumul de ADN extras din probă5,0 μl  
      Volum total25,0 μl
    ________ 1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL. b) PCR specific biovarului 3/4/5
           
      ReactivCantitate per reacţieConcentraţie finală
      Apă ultrapură sterilă14,925 μl  
      Tampon PCR x 1012,5 μl1 x (1,5 mM MgCl2)
      BSA (fracţiune V) (10%)0,25 μl0,1%
      Amestec dNTP (20 mM)0,125 μl0,1 mM
      Primer Rs-1-F (10 μM)1 μl0,4 μM
      Primer Rs-3-R (10 μM)1 μl0,4 μM
      Polimerază Taq (5 U/μl)10,2 μl1 U
      Volumul de ADN extras din probă5,0 μl  
      Volum total25,0 μl
    _________ 1) Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.4.3. Condiţiile reacţiei PCRSe urmează procedura descrisă în continuare pentru reacţiile specifice biovarului 1/2 şi biovarului 3/4/5:
           
      1 ciclu de:(i)5 minute la 95°C: denaturarea matriţei ADN
      35 cicluri de:(ii)30 secunde la 95°C: denaturarea matriţei ADN
        (iii)30 secunde la 58°C: hibridizare cu primeri
        (iv)45 secunde la 72°C: extinderea ADN
      1 ciclu de:(v)5 minute la 72°C (extinderea finală)
        (vi)Se menţine la 4°C.
    NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.4.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimeruluiProdusele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F şi Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzima izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F şi Rs-3-R nu au puncte de restricţie.5. Prepararea tamponului de încărcare5.1. Albastru de bromfenol (soluţie concentrată de 10%)
         
      Albastru de bromfenol5 g
      Apă distilată (bidistilată)50 ml
    5.2. Tampon de încărcare
         
      Glicerol (86%)3,5 ml
      Albastru de bromfenol (5.1)300 μl
      Apă distilată (bidistilată)6,2 ml
    6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10 x, pH 8,0
         
      Tampon TRIS48,40 g
      Acid acetic glacial11,42 ml
      EDTA (sare disodică)3,72 g
      Apă distilată1,00 l
    Înainte de utilizare se diluează până la 1 x.De asemenea, acest tampon este disponibil în comerţ (de exemplu, Invitrogen sau echivalent).Apendicele 7Reactivi validaţi pentru testul FISH1. OligosondeSondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia solanacearum: 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3'Sondă eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'2. Soluţia de fixareAtenţie! Soluţia de fixare conţine paraformaldehidă, care este toxică, se manipulează cu mănuşi şi nu se inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă chimică.(i) Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la circa 60°C şi se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehida se dizolvă după adăugarea a 5 picături de NaOH 1N şi amestecarea pe un agitator magnetic.(îi) Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a 1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) şi 5 picături de HCl 1 N. Se verifică pH-ul cu benzi indicatoare şi se ajustează, atunci când este necesar, cu HCl sau NaOH.Atenţie! Nu se foloseşte pH-metrul în soluţii care conţin paraformaldehidă.(iii) Se filtrează soluţia printr-un filtru cu membrană de 0,22 f2μm şi se păstrează la 4°C până la utilizare ferită de praf.3. Hibmix 3 x
         
      NaCl2,7 M
      Tris/HCl60 mM (pH 7,4)
      EDTA (sterilizată prin filtrare şi autoclavată)15 mM
    Se diluează până la 1 x, după cum este prevăzut. 4. Soluţie de hibridizareHibmix 1 x
         
      Sodiu dodecilsulfat (SDS)0,01%
      Formamidă30%
      Sondă EUB 3385 ng/μl
      Sondă OLI-1 sau OLI-25 ng/μl
    Se prepară cantităţile de soluţie de hibridizare în conformitate cu reţeta din tabelul 1. Pentru fiecare lamă (conţinând două probe diferite duplicate) este nevoie de 90 f2μl de soluţie de hibridizare.Important: Formamida este foarte toxică. Prin urmare, se poartă mănuşi şi se iau măsurile de siguranţă necesare!Tabelul 1. Cantităţi recomandate pentru prepararea amestecului de hibridizare
                 
      Numărul de lame146810
      Apă ultrapură sterilă23,192,4138,6184,8231,0
      Hibmix 3X30,0120,0180,0240,0300,0
      Sodiu dodecilsulfat (SDS) 1%0,93,65,47,29,0
      Formamidă27,0108,0162,0216,0270,0
      Sondă EUB 338 (100 ng/μl)4,518,027,036,045,0
      Sondă OLI-1 sau OLI-2 (100 ng/μl)4,518,027,036,045,0
      Volum total (μl)90,0360,0540,0720,0900,0
    NOTĂ: Toate soluţiile care conţin oligosonde sensibile la lumină se păstrează la întuneric, la - 20°C.Se protejează de lumina directă a soarelui sau de lumina electrică directă în timpul utilizării.5. Tampon fosfat 0,1 M, pH 7,0
         
      Na2HPO48,52 g
      KH2PO45,44 g
      Apă distilată1,00 l
    Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.Apendicele 8Condiţii de cultură pentru vinete şi tomateSe însămânţează seminţe de tomate (Lycopersicon esculentum) şi de vinete (Solanum melongena) în pământ de seră pasteurizat. Se transplantează plantulele în pământ pentru flori pasteurizat atunci când cotiledoanele sunt dezvoltate în totalitate (10-14 zile).Vinetele sau tomatele trebuie cultivate în seră, înainte de inoculare, în următoarele condiţii de mediu:Durata zilei: 14 ore sau durata naturală a zilei atunci când este mai mare
         
      Temperatura:ziua: 21-24°C
        noaptea: 14-18°C
      Varietatea sensibilă de tomată:«Moneymaker»
      Varietatea sensibilă de vânătă:«Black Beauty»
      Furnizori:vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
    REFERINŢE1. Amann, R.I., L Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative. Phylogenetic and environmental studies în microbiology. Ţ. Bacteriol. 1 72: 762-770.2. Anon. 1998. Council Directive 98/5 7/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. l.abarre and B. (ouan. 1999. Design of division specific primers of (Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 10^5; 373-380.4. Caruso, P., Gorris, M.T.. Cambra, M.. Palomo, Ţ.L. Collar, Ţ and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody lor sensitive Detection of Ralstonia solanacearum în Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68. 3634-3638.5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira. L. 1989. Genetic diversity ol Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive respon. se. Molecular PlantMicrobe Interactions 1:113-121.6. Elphinstone. J.G., Hcnnessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanaceamm în potato tuber extracts. FPPO Buletin 26: 663-678.7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. În: A.C. Hayward (ecL) Bacterial Wilt Newsletter 10. 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research. Canberra, Australia.8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics ol Pseudomonas solanacearum. Journal ol Applied Bacteriology 27: 265-277.9. Hayward, A.C., El-Nashaar. H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation în nitrate metabolism în biovars of Pseudomonas solanacearm. Journal of Applied Bacteriology 69: 269-280.10. Ito, S.. Y. Ushijima. T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-lwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum în soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.11. Janse, j.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum în symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Buletin OEPP/EPPO Buletin 18. 343-351.12. Janse. J.D. 1991. Infra- and inlra-spccilic classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatly-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.13. Kelman, A. 1954. The relationship ol pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.14. Klemenl Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods în Phytobacteriology. Akadcmiai Kiado, Budapest, 568 pp.15. Lelliott. R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd.. Oxford. 216 pp.16. Lopez. M.M.. Corns, M.T., Hop, P., Cubero. J., Vicedo, B.. Cambra, M., 1 997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. În: H.W. Dehne ft al., (eds). Klewer Academic Publishers, pp. 117-121.17. Louws, F.J., Fulbright, D.W.. Stephens. C.T. and Dc Bruijn, F.J.. 1994. Specific genomic fingerprints of phytopalhogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, FJ. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85: 528-5 36.19. Opina, N., F. Tavner. G. Holloway, Ţ.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5: 19-33.20. Pastrik, K.H. and Maiss. E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum în potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.21. Pastrik. K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 1 6S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearm, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7. 67-79.23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide fur identification of plant pathogenic bacteria. Schaad fHrsg. ş.-3. cd.: Şi. Paul, Minnesota: 373 pp.24. Seal, S.E., LA. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum. Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by parţial 16S rRNA sequencing: construction of oligonuclc-oiide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1 594.25. Smith)., Offord. I..C, Holderness, M. and Snaddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solamcearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 în Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61: 4262-4268.26. Stead. D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42: 281-295.27. Taghavi. M., Hayward, A.C.O, Sly, L.I, Fcgan, M. 1996. Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46: 10-15.28. Van Der Wolf, J.M.. Bonants. P.J.M.. Smith, J.J., Hagcnaar, M., Nijhuis. E., Van Bcckhoven. J.R.C.. Saddler, G.S.. Trigalet. A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 în Western Europe as determined by AFLP. RC-PFGE and rep-PCR. În: Prior. P., Alien, C. and Elphinstonc. J. (eds.) Bacterial will disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.29. Weller, S.A.. Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead. D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanaceanun, which causes brown rot of potato, by fluorescent în situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.      +  Anexa III1. Pentru fiecare apariţie suspectată pentru care a fost identificat un rezultat pozitiv la testul sau testele de detecţie, în conformitate cu metodele prevăzute în anexa nr. II pentru materialul de plantare şi în toate celelalte cazuri, pentru care este aşteptată confirmarea sau infirmarea, trebuie să se păstreze şi să se conserve în mod corespunzător:- toţi tuberculii prelevaţi şi, în măsura în care este posibil, toate plantele prelevate;- orice extract rămas şi material preparat suplimentar pentru testul sau testele de detecţie, de exemplu, lamele de imunofluorescenţă; şi- toată documentaţia relevantă, până la finalizarea metodei menţionate.Păstrarea tuberculilor permite testarea soiului, efectuată atunci când este cazul.2. În cazul confirmării organismului, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii corespunzătoare:- materialul specificat la pct. 1;- o probă de tomate sau vinete infectate prin inoculare cu extract din tuberculi sau plante, după caz; şi- cultura izolată a organismului, timp de cel puţin o lună după procedura de notificare prevăzută la art. 9 din ordin.  +  Anexa IVElementele din investigaţia prevăzută la art. 8 alin. (2) lit. a) din ordin includ, acolo unde este cazul:(i) locurile de producţie:- în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofii depistaţi ca fiind infectaţi cu acest organism;- în care se cultivă sau au fost cultivate tomate care sunt din aceeaşi sursă cu tomatele depistate ca fiind infectate cu acest organism;- în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi ori tomate care au fost plasaţi sub control oficial datorită apariţiei suspectate a organismului;- în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofii care au fost cultivaţi în locurile de producţie depistate ca fiind infestate cu acest organism;- în care se cultivă cartofi sau tomate şi care sunt situate în vecinătatea unor locuri de producţie infestate, incluzând acele locuri de producţie care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;- care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă din orice sursă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism;- care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă dintr-o sursă folosită în comun cu locurile de producţie confirmate sau suspectate a fi infestate cu acest organism;- care sunt sau au fost inundate cu apa de suprafaţă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism;şi(îi) apă de suprafaţă utilizată la irigare sau stropire sau care a inundat unul sau mai multe câmpuri sau locuri de producţie confirmate a fi infestate cu acest organism.  +  Anexa V1. Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea extinderii contaminării probabile în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c) din ordin includ:- materialul de plantare cultivat într-un loc de producţie desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;- locurile de producţie care au legătură cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, inclusiv cele care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;- materialul de plantare produs în locul sau locurile de producţie prevăzute la liniuţa anterioară sau care se află în aceste locuri de producţie în timpul perioadei în care materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin a fost prezent la locul de producţie prevăzut la prima liniuţă;- spaţiile în care se manipulează materialul de plantare provenit din locurile de producţie menţionate la liniuţele anterioare;- orice utilaj, vehicul, container, depozit sau unităţi ale acestora şi orice alt obiect, inclusiv ambalajul, care au venit în contact cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;- orice material de plantare depozitat în sau în contact cu oricare dintre structurile sau obiectele menţionate la liniuţa anterioară, înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestora;- ca rezultat al investigaţiei şi testării în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. a) din ordin, în cazul cartofilor, acei tuberculi sau plante cu o înrudire clonală colaterală ori parentală şi, în cazul tomatelor, acele plante cu aceeaşi sursă ca materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin şi pentru care apare probabilă contaminarea printr-o legătură clonală, deşi rezultatele testării privind prezenţa organismului pot fi negative. Testarea soiului poate fi efectuată pentru a se verifica identitatea tuberculilor sau a plantelor contaminate şi legătura clonală;- locul sau locurile de producţie a materialului de plantare menţionat la liniuţa anterioară;- locul sau locurile de producţie a materialului de plantare care utilizează pentru irigare ori stropire apă care a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin;- materialul de plantare produs în câmpurile inundate cu apă de suprafaţă confirmată ca fiind contaminată.2. Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea unei posibile răspândiri în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) din ordin includ:(i) în cazurile prevăzute la art. 8 alin. (2) lit. f) din ordin:- vecinătatea altor locuri de producţie care cultivă materialul de plantare;- producţia şi utilizarea în comun a stocurilor de cartofi de sămânţă;- locurile de producţie care utilizează apă de suprafaţă pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare, în cazurile în care există sau a existat riscul de scurgere ori de inundare cu apă de suprafaţă din unul sau mai multe locuri de producţie desemnate ca fiind contaminate în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;(îi) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin:- locul sau locurile de producţie învecinate care produc materialul de plantare sau care sunt în pericol de a fi inundate cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;- orice bazin de irigare îngropat, care are legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;- întinderile de apă în legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată, ţinându-se seama de:- direcţia şi nivelul debitului apei desemnate ca fiind contaminată;- prezenţa plantelor-gazdă sălbatice solanacee.3. Notificarea prevăzută la art. 9 din ordin include:- imediat după confirmarea prezenţei organismului prin teste de laborator, efectuate conform metodelor prevăzute în anexa nr. II, cel puţin:- pentru cartofi: a) denumirea soiului lotului; b) tipul (consum, sămânţă etc.) şi, dacă este cazul, categoria de cartofi de sămânţă;- pentru plantele de tomate, denumirea soiului lotului şi, dacă este cazul, categoria;- fără a prejudicia cerinţele de notificare a unei apariţii suspectate conform art. 7 alin. (2) din ordin, statul membru în care a fost confirmată apariţia, în cazul în care există riscul de contaminare a materialului de plantare provenit din unul sau mai multe state membre, comunică de îndată statului membru sau statelor membre în cauză informaţiile necesare conform art. 10 din ordin, cum ar fi: a) denumirea soiului lotului de cartofi sau tomate; b) numele şi adresa expeditorului şi destinatarului; c) data livrării lotului de cartofi sau tomate; d) mărimea lotului de cartofi sau tomate livrat; e) atunci când este cazul, o copie a paşaportului fitosanitar sau cel puţin numărul paşaportului fitosanitar sau numărul de înregistrare al producătorului sau al comerciantului şi o copie a bonului de livrare.Comisiei i se notifică imediat aceste informaţii.4. Detaliile notificării suplimentare prevăzute la art. 9 alin. (2) din ordin includ, după finalizarea tuturor investigaţiilor, pentru fiecare caz: a) data la care s-a confirmat contaminarea; b) o scurtă descriere a investigaţiilor realizate pentru identificarea sursei şi posibilei răspândiri a contaminării, precizându-se intensitatea prelevării; c) informaţii privind sursa/sursele identificate sau presupuse ale contaminării; d) detalii ale întinderii contaminării desemnate, inclusiv numărul de locuri de producţie, şi pentru cartofi, numărul de loturi, cu indicarea soiului şi, în cazul cartofului de sămânţă, a categoriei; e) detalii ale zonei delimitate, inclusiv numărul de locuri de producţie nedesemnate ca fiind contaminate, dar incluse în zonă; f) detalii ale apei desemnate ca fiind contaminată, inclusiv numele şi amplasarea apei şi întinderea desemnării/interdicţia de irigare; g) pentru orice transport sau lot de plante de tomate desemnat ca fiind contaminat, certificatele fitosanitare prevăzute la art. 11 alin. (2) lit. d) şi alin. (3), (4) şi (5) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 şi numărul paşaportului, în conformitate cu anexa nr. V partea A secţiunea 1 pct. 2.2 din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007; h) toate celelalte informaţii pe care Comisia le solicită, referitoare la focarul sau focarele confirmate.  +  Anexa VI1. Prevederile art. 11 din ordin se referă la:- utilizarea în hrana animalelor după tratamentul termic, astfel încât să nu existe niciun risc de supravieţuire a organismului; sau- eliminarea deşeurilor într-un loc autorizat de distrugere, în mod oficial, în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenuri agricole sau prin contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole; sau- incinerare; sau- transformarea industrială prin livrare directă şi imediată la o fabrică de procesare care dispune de instalaţii de eliminare a deşeurilor, autorizate oficial, despre care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi că dispune de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau- alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului; aceste măsuri şi justificarea lor trebuie să fie notificate Comisiei şi celorlalte state membre.Toate deşeurile asociate şi care rezultă din operaţiile menţionate anterior sunt eliminate prin metode aprobate oficial în conformitate cu anexa nr. VII.2. Utilizarea sau eliminarea corespunzătoare a materialului de plantare prevăzut la art. 12 din ordin, sub controlul organismelor oficiale responsabile ale statului membru sau ale statelor membre în cauză, prin comunicări corespunzătoare între organismele oficiale responsabile pentru a asigura controlul permanent şi aprobarea de către organismele oficiale responsabile ale statului membru în care cartofii urmează să fie ambalaţi sau procesaţi, cu privire la instalaţiile de eliminare a deşeurilor menţionate la prima şi a doua liniuţă, include:(i) pentru tuberculii de cartofi:- utilizarea acestora drept cartofi destinaţi consumului gata ambalaţi pentru livrare şi utilizarea directă, fără reambalare, într-un loc care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor. Cartofii destinaţi plantării pot fi manipulaţi în acelaşi loc, numai dacă sunt manipulaţi separat sau după curăţarea şi dezinfectarea acestuia; sau- utilizarea acestora drept cartofi de consum destinaţi procesării industriale după livrare directă şi imediată la o fabrică de prelucrare care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau- un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi supus aprobării de către organismele oficiale responsabile;(îi) pentru alte părţi de plantă, inclusiv resturi de tulpini şi frunze:- distrugerea; sau- un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi supus aprobării de către organismele oficiale responsabile.3. Metodele corespunzătoare de decontaminare a obiectelor prevăzute la art. 13 din ordin sunt curăţarea şi, dacă este cazul, dezinfectarea, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului. Aceste metode sunt aplicate sub control oficial.4. Măsurile care trebuie puse în aplicare în zona (zonele) demarcată(e), stabilită(e) conform art. 8 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) din ordin şi menţionate la art. 14 din ordin includ:4.1. atunci când locurile de producţie au fost desemnate ca fiind contaminate conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin: a) într-un câmp sau într-o unitate de producţie de cultură protejată desemnată ca fiind contaminată conform cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;(i) în cursul a cel puţin 4 ani de cultură care urmează contaminării desemnate:- sunt luate măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartof şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului, inclusiv a buruienilor solanacee; şi- nu se plantează următoarele:- tuberculi, plante sau seminţe de cartof;- plante şi seminţe de tomate;- ţinându-se seama de biologia organismului;- alte plante-gazdă;- plante din specia Brassica pentru care există un risc identificat de supravieţuire a organismului;- culturi pentru care există un risc identificat de răspândire a organismului;- în primul sezon de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioada specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale pentru cel puţin 2 ani consecutivi de cultură înainte de plantare;- în cazul cartofilor, se va autoriza numai producţia de cartofi pentru consum;- în cazul cartofilor şi tomatelor, tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate vor fi testate, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II;- în sezonul de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează celui prevăzut la liniuţa anterioară şi după un ciclu adecvat de rotaţie, care trebuie să fie de minimum 2 ani, se autorizează plantarea cartofilor de sămânţă şi se efectuează inspecţii oficiale conform art. 2; sau(îi) pe parcursul a 5 ani de cultură care urmează anului contaminării desemnate:- se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului prezente în mod spontan, inclusiv a buruienilor solanacee; şi- terenul trebuie menţinut, în cursul primilor 3 ani, înţelenit sau cultivat cu cereale în conformitate cu riscul identificat sau ca păşune permanentă şi în acest caz este frecvent cosit scurt sau păşunat intensiv sau cultivat cu iarbă pentru producţia de seminţe, urmată de plantarea în următorii 2 ani cu plante care nu sunt gazdă organismului pentru care nu există un risc identificat de supravieţuire sau răspândire a organismului;- în primul sezon de cultivare a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioadă specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale timp de cel puţin 2 ani consecutivi înainte de plantare:- în cazul cartofilor, se autorizează producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;- tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate se testează, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II; b) în toate celelalte terenuri din locul de producţie contaminat şi cu condiţia ca organismele oficiale să aibă certitudinea că riscul reprezentat de plantele spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv buruienile solanacee prezente în mod spontan, a fost eliminat:- în anul de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:- fie nu se plantează niciun tubercul, plantă, sămânţă de cartof sau altă plantă-gazdă a organismului; sau- în cazul tuberculilor de cartof, cartofii de sămânţă certificaţi pot fi plantaţi numai pentru producţia destinată consumului;- în cazul plantelor de tomate, răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 poate fi plantat numai pentru producţia de fructe;- în al doilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:- în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămânţă certificaţi sau cartofi de sămânţă testaţi oficial pentru detecţia prezenţei veştejirii bacteriene şi cultivaţi sub control oficial în locuri de producţie, altele decât cele prevăzute la pct. 4.1 pentru producţia de cartofi de sămânţă sau consum;- în cazul tomatelor, numai răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative din plante de tomate obţinute din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial în locuri de producţie, altele decât cele menţionate la pct. 4.1, poate fi plantat fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;- în cel de-al treilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:- în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămânţă certificaţi sau cultivaţi sub control oficial proveniţi din cartofi de sămânţă certificaţi pentru producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;- în cazul tomatelor, se plantează numai răsad de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau plante de tomate obţinute sub control oficial din astfel de plante, fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;- în fiecare dintre anii de cultivare prevăzuţi la liniuţele anterioare, se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi a altor plante-gazdă ale organismului şi se desfăşoară inspecţii oficiale ale culturii în perioade adecvate şi, pe fiecare câmp de cartofi, cartofii recoltaţi sunt testaţi oficial în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II; c) imediat după desemnarea contaminării în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin şi după primul an de cultivare care urmează:- toate utilajele şi instalaţiile de depozitare de la locul de producţie şi implicate în producţia cartofilor sau tomatelor sunt curăţate şi, după caz, dezinfectate, utilizându-se metodele corespunzătoare prevăzute la pct. 3;- sunt introduse controale oficiale ale programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, pentru a preveni răspândirea organismului atunci când este cazul; d) într-o unitate de producţie de cultură protejată, desemnată ca fiind contaminată conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, unde este posibilă înlocuirea completă a mediului de creştere:- nu se plantează niciun tubercul, nicio plantă sau sămânţă de cartof ori alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv plante şi seminţe de tomate, cu excepţia cazului în care unitatea de producţie respectivă a fost supusă măsurilor oficiale de control pentru eliminarea organismului şi pentru îndepărtarea întregului material vegetal gazdă, inclusiv o schimbare completă a mediului de cultură, curăţarea şi, după caz, dezinfectarea unităţii respective, a întregului echipament şi în care a fost acordată ulterior aprobarea pentru producţia de cartofi sau tomate din partea organismelor oficiale responsabile; şi- pentru producţia de cartofi, această producţie trebuie să provină din cartofi de sămânţă certificaţi sau din minituberculi ori microplante provenite din surse testate;- pentru producţia de tomate, această producţie trebuie să provină din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad de tomate provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial;- sunt introduse controale oficiale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, pentru prevenirea răspândirii organismului, atunci când este cazul.4.2. Fără a prejudicia măsurile descrise la pct. 4.1, organismele oficiale responsabile în cadrul zonei demarcate: a) imediat după contaminarea desemnată, se asigură că toate echipamentele şi instalaţiile de depozitare din astfel de locuri şi implicate în producţia de cartofi sau de tomate sunt curăţate şi dezinfectate corespunzător, în conformitate cu metodele descrise la pct. 3; b) imediat după desemnarea contaminării şi timp de cel puţin 3 ani de cultivare:(ba) în cazurile în care zona demarcată a fost determinată conform art. 8 alin. (2) lit. f) din ordin:- se asigură supravegherea de către organismele oficiale a locurilor de cultivare, depozitare sau de manipulare a tuberculilor de cartofi sau a tomatelor, împreună cu locurile în care funcţionează utilajele pentru prelucrarea cartofilor sau a tomatelor;- se solicită plantarea doar a seminţelor certificate sau a seminţelor cultivate sub control oficial pentru toate culturile de cartofi din zona respectivă şi testarea după recoltare a cartofilor de sămânţă cultivaţi în locurile de producţie desemnate ca fiind probabil contaminate în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. e) din ordin;- se solicită manipularea separată a stocurilor de cartofi de sămânţă recoltaţi faţă de cele destinate consumului în toate locurile din zona respectivă sau punerea în aplicare a unui sistem de curăţare şi, după caz, de dezinfecţie între procedurile de manipulare a stocurilor de cartofi de sămânţă şi a celor destinaţi consumului;- se solicită plantarea numai a plantelor de tomate provenite din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial, pentru toate culturile de tomate din zona respectivă;- se desfăşoară inspecţii oficiale în conformitate cu art. 2 din ordin;(bb) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost declarată contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin sau inclusă printre elementele de răspândire posibilă a organismului în conformitate cu anexa nr. V pct. 2:- se desfăşoară inspecţii anuale în perioade adecvate, inclusiv prelevarea de probe de apă de suprafaţă şi, după caz, a plantelor-gazdă solanacee din sursele relevante de apă, precum şi testarea în conformitate cu metodele stabilite în anexa nr. II pentru materialul de plantare şi pentru celelalte cazuri;- se introduc controale oficiale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a utilizării apei desemnate ca fiind contaminată pentru irigarea şi stropirea materialului de plantare şi, după caz, a altor plante-gazdă, pentru a preveni răspândirea organismului. Această interdicţie poate fi revizuită în baza rezultatelor obţinute din inspecţiile anuale şi desemnările de contaminare pot fi retrase atunci când organismele oficiale responsabile sunt sigure că apele de suprafaţă nu mai sunt contaminate. Utilizarea apei supuse interdicţiei poate fi autorizată sub control oficial, pentru irigarea şi stropirea plantelor-gazdă în cazul în care tehnicile aplicate, autorizate oficial, elimină organismul şi împiedică răspândirea acestuia;- în cazurile în care deşeurile lichide deversate sunt contaminate, se introduc controale oficiale pentru eliminarea deşeurilor solide ori lichide din fabricile de procesare industrială sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare; c) se stabileşte un program, după caz, de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de sămânţă într-o perioadă de timp corespunzătoare.  +  Anexa VIIMetodele de eliminare a deşeurilor aprobate oficial, prevăzute la pct. (1) din anexa nr. VI, trebuie să fie în conformitate cu următoarele prevederi, astfel încât să se evite orice risc identificabil de răspândire a organismului:(i) deşeurile de cartofi şi tomate (inclusiv cartofii respinşi, cojile şi tomatele), precum şi orice alt deşeu solid asociat cartofilor şi tomatelor (inclusiv solul, pietrele şi alte resturi) sunt eliminate, fie:- într-un loc autorizat de eliminare a deşeurilor aprobat oficial în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenurile agricole sau în contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole. Deşeurile sunt transportate direct în locurile respective în condiţii de izolare, astfel încât să nu existe riscul răspândirii acestora; sau- prin incinerare; sau- prin alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului. Aceste măsuri trebuie notificate Comisiei şi celorlalte state membre;(îi) deşeurile lichide: înainte de eliminare, deşeurile lichide care conţin particule solide în suspensie trebuie să fie supuse unui procedeu de filtrare sau de sedimentare pentru a le îndepărta. Aceste particule solide vor fi eliminate conform pct. (i).Apoi deşeurile lichide sunt ulterior:- complet încălzite la o temperatură de 60°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de a fi eliminate; sau- eliminate într-un alt mod, aprobat oficial şi sub control oficial, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil ca deşeurile să între în contact cu terenurile agricole sau cu surse de apă care ar putea fi folosite pentru irigarea terenurilor agricole. Detaliile cu privire la aceasta sunt notificate celorlalte state membre şi Comisiei.Procedurile descrise în prezenta anexă se aplică, de asemenea, şi deşeurilor rezultate de la manipularea, eliminarea şi prelucrarea loturilor contaminate._________