NORMA SANITARĂ VETERINARA din 18 octombrie 2002privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare de probe şi criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator, pentru confirmarea şi diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului
EMITENT
  • MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTAŢIEI ŞI PĂDURILOR
  • Publicat în  MONITORUL OFICIAL nr. 878 din 5 decembrie 2002



     +  Articolul 1 (1) Autoritatea veterinara centrala a României trebuie să se asigure ca la baza confirmării bolii veziculoase a porcului şi a diagnosticului diferential al acesteia de febra aftoasa se afla: a) detectarea semnelor clinice de boala; b) detectarea virusului, antigenului sau a genomului în probe de tesut epitelial, lichid vezicular sau în fecale; c) demonstrarea unui răspuns specific de anticorpi în probele de ser, conform procedurilor; d) metodele de prelevare de probe şi criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator stabilite în manualul prevăzut în anexa. (2) Laboratoarele de diagnostic la care se referă pct. 5 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului pot aplica modificări ale testelor de laborator la care se referă manualul prevăzut în anexa sau pot utiliza teste diferite, cu condiţia ca acestea sa demonstreze sensibilitate şi specificitate egala cu a celor nemodificate. (3) Sensibilitatea şi specificitatea acestor teste modificate sau diferite trebuie să fie evaluate în cadrul unor testări comparative periodice, organizate de laboratorul de referinţa comunitar pentru boala veziculoasa a porcului.  +  Articolul 2 (1) Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta documente legislative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme sanitare veterinare pentru a asigura aplicarea şi respectarea prevederilor acesteia. (2) Autoritatea veterinara centrala a României va lua măsurile administrative sau penale adecvate pentru a pedepsi orice încălcare a prevederilor prezentei norme sanitare veterinare. (3) Autoritatea veterinara centrala a României poate modifica, completa sau abroga total sau parţial prevederile prezentei norme sanitare veterinare. (4) Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să facă o referire expresă la prezenta norma sanitară veterinara.  +  Articolul 3Anexa face parte integrantă din prezenta norma sanitară veterinara.  +  Anexă────────la norma sanitară veterinara────────────────────────────MANUALde proceduri de diagnostic, metode de prelevare de probe şi criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea şi diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului  +  Capitolul 1 Introducere, obiective şi definiţii1. Prezentul manual de proceduri de diagnostic cuprinde metode de prelevare de probe şi criterii pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru confirmarea şi diagnosticul diferential al bolii veziculoase a porcului: a) principiile de baza şi condiţiile minime privind procedurile de diagnostic, metodele de prelevare de probe şi criteriile pentru evaluarea rezultatelor testelor de laborator pentru un diagnostic corespunzător al bolii veziculoase a porcului. O importanţa deosebită se acordă diagnosticului diferential cu febra aftoasa; b) prevederile anexei nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului şi, în special, pct. 4, 7 şi 8 ale anexei menţionate; c) informaţii folosite în primul rând de autorităţile responsabile pentru controlul bolii veziculoase a porcului, accentul fiind pus pe principiile şi aplicatiile testelor de laborator şi pe evaluarea rezultatelor acestora şi nu pe tehnici detaliate de laborator.2. Conform prezentului manual, se înţelege prin: a) porc seropozitiv - orice porc al cărui ser are un titru de anticorpi egal sau mai mare decât serul 4 de referinţa al bolii veziculoase a porcului la care se referă cap. X; b) reactant unic - orice porc singur seropozitiv dintr-o exploatatie, care dezvolta un rezultat pozitiv la teste serologice pentru boala veziculoasa a porcului, dar care nu are antecedente de contact cu virusul bolii veziculoase a porcului şi pentru care nu exista vreo dovada a răspândirii infectiei la porcii de contact. Un porc seropozitiv este confirmat ca reactant unic dacă sunt îndeplinite condiţiile la care se referă cap. VIII lit. C; c) porci de contact - porci care au contact direct sau au avut contact direct, în ultimele 28 de zile, cu unul sau mai mulţi porci seropozitivi sau cu unul sau mai mulţi porci suspecti de a fi infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului. Porcii de contact pot fi cazati în aceeaşi boxa sau în boxe adiacente, dacă exista posibilitatea contactului porcilor între boxe.  +  Capitolul 2 Principii de bază pentru controlul porcilor care prezintă semne clinice ale bolii veziculoase a porcului1. Când într-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii veziculoase a porcului, un număr statistic semnificativ de porci trebuie să fie verificat de către medicul veterinar oficial, cat mai curând posibil, pentru a se detecta eventuale semne clinice ale bolii la care se referă prezenta anexa.2. Când porcii prezintă semne clinice pe baza cărora se suspicioneaza boala veziculoasa a porcului sau febra aftoasa, este efectuat, cat mai curând posibil, diagnosticul diferential, prin mijloace adecvate de prelevare de probe şi investigaţii de laborator, conform prevederilor cap. IV, VII şi VIII.  +  Capitolul 3 Proceduri generale pentru prelevare şi transport de probe1. Orice persoană care intra sau iese din exploataţii de porci, atunci când exista o suspiciune de boala veziculoasa a porcului, trebuie să respecte măsurile de igiena cele mai stricte, necesare pentru a reduce riscul contaminarii sau răspândirii cu virus.2. Toţi porcii de la care au fost prelevate probe trebuie să fie marcati individual în asa fel încât să poată fi identificati pentru eventuale reprelevari de probe. Se recomanda să fie înregistrată localizarea fiecărui porc din exploatatie de la care au fost prelevate probe, împreună cu marca sa individuală de identificare, în special dacă au fost prelevate probe de la porci suspecti.3. Probele trebuie să fie trimise la laborator, însoţite de documentele corespunzătoare, care vor include detalii ale antecedentelor clinice ale porcilor de la care au fost prelevate probe şi semnele clinice observate, dacă exista.4. Atât timp cat orice afectiune veziculoasa la porci poate fi suspectata ca fiind febra aftoasa, trebuie să fie luate precautii speciale pentru impachetarea în condiţii de siguranţă maxima a probelor suspecte. Aceste precautii se referă la prevenirea spargerii sau fisurarii containerelor, precum şi la riscul contaminarii, fiind, de asemenea, important să se asigure ca probele sa ajungă la laborator într-o stare satisfăcătoare. Dacă este pusă gheaţa în interiorul unui astfel de pachet, trebuie să fie prevenite scurgerile de apa. Nici un container ce conţine probe suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului nu trebuie să fie deschis decât când a ajuns în laborator.5. Probele suspecte de contaminare cu virusul bolii veziculoase a porcului trebuie să fie analizate numai într-un laborator autorizat pentru a manipula virusul febrei aftoase în scopul diagnosticului, conform legislaţiei naţionale cu privire la controlul febrei aftoase, chiar dacă suspiciunea de febra aftoasa a fost deja eliminata.6. Toate probele vor fi transportate la temperatura de 4°C, dacă durata transportului până la laboratorul de destinaţie este mai mica de 48 ore, sau la o temperatura maxima de -20°C, dacă durata transportului este mai mare.7. Pentru probe destinate laboratorului de referinţa comunitar singura metoda de transport permisă este pe calea aerului via aeroportul din Londra (Heathrow) sau aeroportul Gatwick. Înainte de imbarcarea probelor laboratorul respectiv trebuie să fie informat prin fax (+44-1483 23 26 21) sau prin e-mail despre detaliile de zbor, data, timpul de sosire prevăzut şi numărul zborului, pentru ca pachetul să poată fi localizat la sosire. Pachetul trebuie să fie adresat Institutului pentru Sănătate Animala, Laboratorul Pirbright, Laboratorul de referinţa comunitar pentru boala veziculoasa a porcului, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF, Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord, UK.Următoarele informaţii trebuie, de asemenea, să fie incluse pe eticheta: "Material patologic animal fără valoare comercială. Perisabil. Fragil. A fi ridicat din aeroport prin adresa. A nu fi deschis în afară laboratorului". Ridicarea autorizata a pachetului la aeroport se efectuează de personalul de la laboratorul de referinţa comunitar, în baza unei autorizaţii generale de import special emisă în acest scop de Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi Pescuitului din Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord. Acesta este un acord permanent, o licenta separată care nu este solicitată pentru orice import. Transportul ca bagaj de mana al materialului vezicular suspect de către personal neautorizat, în Regatul Unit al Marii Britanii şi Irlandei de Nord, precum şi prin companiile de curierat este interzis.8. Transportul probelor la laboratoarele naţionale trebuie să fie conform instrucţiunilor stabilite de autoritatea veterinara centrala a României.  +  Capitolul 4 Proceduri de prelevare a probelor într-o exploatatie cu porci suspecti clinic1. Când într-o exploatatie este suspectata prezenta virusului bolii veziculoase a porcului şi au fost observate semne clinice de boala, trebuie să fie prelevate probe corespunzătoare de la grupuri reprezentative de porci care prezintă aceste semne, pentru a se confirma boala şi a se efectua diagnosticul diferential faţă de febra aftoasa.2. În aceste exploataţii probele de referinţa pentru diagnostic sunt epiteliul şi lichidul vezicular recoltat de la vezicule proaspăt rupte sau nerupte şi prelevate de la porci care prezintă semne tipice de boala şi la care pot fi detectate virusul bolii veziculoase a porcului, antigenele sau genomul acestora. Se recomanda să fie prelevate probe de la 5 sau 6 asemenea porci.3. Chiar dacă sunt disponibile tesut epitelial proaspăt şi lichid vezicular în cantitate suficienta (1 g sau mai mult), trebuie să fie prelevate şi următoarele probe: a) probe de sânge de la porci suspecti şi porcii de contact, pentru testare serologica; b) probe de fecale de la porci suspecti, de pe podeaua boxei acestora şi de la boxele adiacente, pentru testare virusologica.4. Probele trebuie să fie prelevate şi transportate conform următoarelor proceduri: a) pentru probe epiteliale şi lichid vezicular:1. trebuie să fie prelevat, dacă este posibil, cel puţin 1 g de tesut epitelial de la o vezicula rupta recent sau una nerupta. Se recomanda ca porcii să fie sedati înainte ca probele să fie prelevate, pentru a se evita vătămarea personalului şi din motive de bunastare a porcilor;2. dacă transportul probelor către laboratorul naţional este efectuat imediat - în mai puţin de 3 ore -, probele epiteliale pot fi transportate uscate şi păstrate refrigerate. Dacă durata transportului depăşeşte 3 ore, probele trebuie să fie puse într-un mediu de transport de volum mic, care consta din cantităţi egale de glicerol şi 0,04 M fosfat-tampon sau alte substanţe-tampon echivalente, astfel încât pH-ul să fie menţinut în limita optima pentru supravietuirea virusului febrei aftoase (pH de la 7,2 la 7,6). Mediul de transport trebuie să conţină antibiotice pentru activitate suplimentară antimicrobiana. Antibioticele corespunzătoare şi concentratiile acestora per ml, definitive, sunt: 1.000 U.I. penicilina, 100 U.I. neomicina sulfat, 50 U.I. polimixina B sulfat, 100 U.I. micostatin;3. dacă poate fi prelevat lichid vezicular de la o vezicula nerupta, acesta trebuie să fie păstrat nediluat, într-un container separat; b) pentru probe de sânge: pot fi prelevate probe de sânge pentru teste serologice sau virusologice. În general, acestea sunt prelevate pentru detectarea anticorpilor şi doar de la porci suspecti de a se fi insanatosit de infectia clinica sau subclinica, în timp ce epiteliul, lichidul vezicular şi probele de fecale de la porci care prezintă semne clinice de boala sunt mult mai adecvate pentru detectarea virusului decât probele de sânge. Se recomanda ca probele de sânge integral să fie prelevate folosindu-se seringi vacuumate fără anticoagulant, iar acestea trebuie să fie transportate fără a fi deschise; c) pentru probe de fecale:1. probe de fecale recoltate de pe podeaua clădirilor suspectate de a conţine sau de a fi conţinut porci infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului sau tampoane fecale şi probe de fecale de la porci în viaţa suspecti trebuie să fie plasate în containere solide şi rezistente la scurgeri;2. containerele cu probe suspecte trebuie să fie dezinfectate pe dinafara, înainte de a fi transportate la laborator. Dezinfectantii corespunzatori sunt:(i) hidroxidul de sodiu (dilutie 1:100);(îi) formolul (dilutie 1:9 de soluţie de formol care conţine minimum 34% formaldehida); şi(iii) hipocloritul de sodiu (cu 2% clor disponibil).Aceşti dezinfectanti trebuie să fie manevrati cu grija, deoarece sunt caustici.  +  Capitolul 5 Proceduri de prelevare a probelor pentru supravegherea serologica a bolii veziculoase a porcului1. Pentru supravegherea exploataţiilor, atunci când nu exista nici o evidenta sau o suspiciune ca boala poate fi prezenta, se efectuează prin prelevare de probe serologice de rutina.2. Pentru supravegherea la abator, la piaţa, la un centru de colectare sau în locuri similare, se efectuează prin prelevare de probe serologice de rutina.3. Pentru supravegherea nediscriminatorie a porcilor primiţi din state membre ale Uniunii Europene, probele de sânge pentru testarea serologica trebuie să fie prelevate de la porci din exploatatiile în care au fost introdusi, conform prevederilor legale în vigoare.4. Pentru supravegherea exploataţiilor situate în cadrul zonelor de protecţie sau de supraveghere care au fost stabilite ca urmare a confirmării focarelor de boala, conform pct. 7 şi 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, sau pentru supravegherea exploataţiilor la care se referă art. 9 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, probele de sânge trebuie să fie prelevate de la porci, pentru testare serologica, conform cu următoarea schema: a) în cazul exploataţiilor pentru reproducţie trebuie să fie efectuată o procedură aleatorie de prelevare de probe, în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate; b) în cazul exploataţiilor care conţin numai porci pentru ingrasare, procedura de prelevare de probe trebuie să asigure ca numărul total de probe prelevate să fie cel puţin egal cu numărul necesar pentru a se detecta o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate. În orice caz probele trebuie să fie prelevate, pe cat este posibil, de la cat mai multe boxe selectate aleatoriu; c) în cazul exploataţiilor mixte, de creştere şi reproducţie, trebuie să fie prelevate probe de la fiecare grup de porci care este cazat în clădiri separate, în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 5% de seroconversie cu 95% fidelitate.  +  Capitolul 6 Acţiuni ulterioare şi proceduri de reprelevare de probe în cazul detectarii de porci seropozitivi1. Când într-o exploatatie este detectat un singur porc seropozitiv în urma supravegherii la care se referă cap. V pct. 1 sau 4, autoritatea veterinara locală trebuie: a) să aplice măsurile la care se referă art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului; b) să efectueze un control în exploatatie conform prevederilor cap. II pct. 1; c) sa preleveze probe de sânge pentru testarea serologica de la:- porcul suspect;- porcii de contact care sunt cazati în aceeaşi boxa sau în boxe adiacente cu porcul suspect. Trebuie să fie prelevate probe de la aceşti porci în asa fel încât să se detecteze o prevalenta de 50% de seroconversie cu 95% fidelitate pentru fiecare boxa.2. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice măsurile la care se referă pct. 1 lit. a) al prezentului capitol, dacă: a) ancheta epizootologica efectuată conform prevederilor art. 8 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusă în exploatatie; b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie; şi c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie, stabilită ca urmare a unui focar de boala confirmat, nu este supusă altor restrictii aplicate cu privire la un focar de boala confirmat şi cu condiţia ca:- nici un porc din exploatatie sa nu facă obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene; şi- porci de la exploatatia respectiva să fie livraţi doar la un abator pentru a fi taiati imediat sau la alta exploatatie din care nici un porc nu face obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene, până când rezultatele controalelor ulterioare şi ale testelor serologice arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi eliminata definitiv.3. Dacă controalele şi testele serologice efectuate conform pct. 1 lit. b) şi c) ale prezentului capitol: a) au rezultate negative sau numai un porc pozitiv este în prealabil confirmat pozitiv (reactant unic), boala veziculoasa a porcului poate fi infirmata. Măsurile la care se referă pct. 1 lit. a) vor fi ridicate, cu excepţia cazului când exploatatia se afla într-o zona de protecţie sau de supraveghere stabilită în jurul unui focar de boala, unde măsurile de eradicare a bolii trebuie să fie în vigoare, conform pct. 7 sau 8 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului; b) arata faptul ca este prezent mai mult de un porc seropozitiv în exploatatie, boala veziculoasa a porcului trebuie să fie confirmată sau, dacă condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite pentru a confirma prezenta acestei boli, trebuie să fie prelevate din exploatatie ulterior probe conform procedurilor de prelevare de probe la care se referă pct. 4 al prezentului capitol.4. În cazul în care este detectat mai mult de un porc seropozitiv într-o exploatatie, ca urmare a prelevarii de probe şi a testelor serologice la care se referă cap. V pct. 1 şi 3 sau pct. 2 al prezentei anexe, iar condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma boala veziculoasa a porcului autoritatea veterinara centrala a României trebuie să dispună următoarele: a) aplicarea sau continuarea aplicării prevederilor art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului; b) efectuarea unui control în acea exploatatie, conform prevederilor cap. II pct. 1; c) prelevarea ulterior de probe de sânge pentru testarea serologica de la porci seropozitivi şi de la porcii de contact, conform pct. 1 lit. c) al prezentului capitol; d) prelevarea probelor de sânge pentru testarea serologica de la porcii din alte clădiri ale exploatatiei, conform procedurii cap. V pct. 2; e) prelevarea unui număr suficient de probe de fecale pentru testele virusologice:(i) de la porci seropozitivi;(îi) de pe podeaua boxelor care conţin porci seropozitivi şi a boxelor adiacente;(iii) din boxe selectate aleatoriu din alte clădiri ale exploatatiei - probele de fecale prelevate trebuie să fie examinate cat mai curând posibil, conform prevederilor pct. (i) şi (îi).Dacă aceste probe sunt negative, dar rezultatele testelor serologice creează suspiciunea ca virusul bolii veziculoase a porcului poate fi răspândit la celelalte clădiri, trebuie prelevate probe de fecale conform prevederilor pct. (iii), pentru a fi examinate; dacă în urma acestor controale şi teste ulterioare condiţiile stabilite la pct. 4 din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului nu sunt îndeplinite, pentru a se confirma prezenta bolii veziculoase a porcului, porcii seropozitivi vor fi ucisi sau taiati, conform prevederilor pct. 4 lit. d) din anexa nr. 2 la Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului. Dacă ulterior au fost gasiti mai mulţi porci seropozitivi, pe lângă ceilalţi deja gasiti seropozitivi ca urmare a prelevarii de probe anticipate, prevederile şi procedurile stabilite la lit. a), b), c), d) şi e) ale prezentului punct vor fi aplicate ulterior mutatis mutandis.5. Fără a aduce atingere măsurilor prevăzute la art. 9 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, când unul sau mai mulţi porci sunt detectati pozitiv, ca urmare a activităţii de supraveghere la care se referă cap. V pct. 2 sau 3, autoritatea veterinara centrala a României va dispune: a) efectuarea controalelor ulterioare corespunzătoare, când este necesar, care includ şi prelevarea de probe, pentru a se confirma sau a se infirma boala veziculoasa a porcului în locul unde aceşti porci au fost detectati, luând în considerare situaţia epizootologica locală; b) aplicarea în exploatatia de origine a acestor porci a măsurilor prevăzute la art. 4 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului; c) efectuarea unui control în exploatatia de origine a acestor porci, conform prevederilor cap. II pct. 1; şi d) prelevarea probelor de sânge de la porcii din exploatatia de origine pentru testarea serologica a porcilor seropozitivi, conform prevederilor cap. V pct. 2.6. Autoritatea veterinara centrala a României poate decide sa ridice măsurile prevăzute la pct. 5 lit. b) al prezentului capitol, dacă: a) ancheta epizootologica, efectuată conform prevederilor art. 4 şi 8 din Norma sanitară veterinara privind măsurile generale pentru controlul unor boli ale animalelor şi măsurile specifice referitoare la boala veziculoasa a porcului, arata ca boala veziculoasa a porcului nu a fost introdusă în exploatatie; b) nici un semn clinic de boala veziculoasa a porcului nu a fost detectat în exploatatie; c) exploatatia nu este situata într-o zona de supraveghere sau de restrictie stabilită ca urmare a confirmării unui focar de boala şi nu este supusă altor restrictii aplicate pentru a se confirma un focar de boala, cu condiţia ca:(i) nici un porc din exploatatie sa nu facă obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene; şi(îi) porcii din exploatatie să fie destinaţi doar tăierii imediate, la un abator sau la alta exploatatie de la care nici un porc nu face obiectul comerţului României cu statele membre ale Uniunii Europene, până când rezultatele controalelor ulterioare şi ale testelor serologice efectuate în locul unde au fost detectati porci seropozitivi şi în exploatatia de origine arata ca boala veziculoasa a porcului poate fi cu certitudine infirmata.  +  Capitolul 7 Principii şi aplicaţii ale testelor virusologice şi evaluarea rezultatelor lorA. Detectarea antigenului viral1. Un test sandwich ELISA indirect înlocuieşte testul de fixare a complementului, ca metoda selectata pentru detectarea antigenului viral al bolii veziculoase a porcului. Testul este acelaşi ca cel utilizat pentru diagnosticul febrei aftoase. Testele pentru cele doua boli trebuie să fie efectuate în acelaşi timp, cu excepţia cazului în care febra aftoasa a fost deja infirmata. Se recomanda în special probe de epiteliu sau de lichid din leziunile veziculoase, în care atât virusul bolii veziculoase a porcului, cat şi cel al febrei aftoase pot fi prezente la titruri înalte la porcii cu infectie acuta şi care sunt detectati în câteva ore*1).──────────────*1) Rezultatele pozitive ELISA sunt asociate cu prezenta a cel puţin 10 5 TCID50 - doze infectioase de cultura de tesut - de virus în probe.Randuri duplicat din plăcile ELISA multigodeu sunt acoperite cu antiser de iepure contra virusului bolii veziculoase a porcului şi pentru fiecare dintre cele 7 serotipuri ale virusului febrei aftoase. Acestea sunt seruri de blocare. Suspensii ale probei de testat se adauga la fiecare godeu al celor două randuri. Controale pozitive sunt de asemenea incluse. Ser de detectie omolog de cobai este adăugat în godeurile din randurile respective, în etapa următoare ori apoi, de ser de iepure anticobai conjugat cu o enzima, cum ar fi peroxidaza de hrean. Se realizează spalarea intensiva între fiecare etapa, pentru a se îndepărta reagentii nelegati.O reactie pozitiva este indicată dacă exista o reactie de culoare la adăugarea cromogenului şi a substratului. Reactiile intens pozitive pot fi evidentiate cu ochiul liber, dar rezultate pot să fie citite, de asemenea, spectrofotometric, caz în care o citire a absorbantei de 0,1 deasupra limitei de fond indica o reactie pozitiva.2. Pot fi folosite sisteme alternative bazate pe anticorpi monoclonali, sisteme care selecteaza anticorpi monoclonali precum anticorpii de blocare şi anticorpii peroxidazo-conjugati monoclonali ca anticorpi de detectie, pentru detectarea antigenului bolii veziculoase a porcului şi pentru diagnosticul diferential de febra aftoasa în probele de epiteliu, lichid vezicular sau cultura de tesut infectat.3. Poate fi folosit un sistem bazat pe anticorpi monoclonali pentru a se studia variatia antigenica dintre tulpinile virusului bolii veziculoase a porcului. Antigenele virale crescute în tesutul-cultura sunt blocate de un antiser hiperimun de iepure contra bolii veziculoase a porcului, adsorbit de faza solida. Secvente corespunzătoare de anticorpi monoclonali reactioneaza şi legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile sălbatice este comparata cu legarea anticorpilor monoclonali la tulpinile parentale. O legătură similară indica prezenta epitopilor, impartiti între tulpinile parentale şi cele sălbatice.B. Izolarea şi creşterea virusului1. Ca rutina, suspensii filtrate de probe de epiteliu, lichid vezicular sau fecale suspecte de a conţine virusul bolii veziculoase a porcului trebuie să fie inoculate pe culturi de celule sensibile. Dacă cantitatea şi calitatea probelor prelevate din leziuni şi supuse examinării sunt insuficiente pentru examinarea imediata prin ELISA, este necesară creşterea de virus în cultura de tesut pentru a amplifica antigenul viral.2. Pentru a izola şi a creşte virusul, suspensia epiteliala filtrata este inoculata pe culturi monostrat de celule IB-RS-2. Trebuie să fie utilizate doua dilutii de suspensie epiteliala, una de concentraţie mare (1/500) şi una de concentraţie mica (1/10) pentru a evita interferenta cu virusul crescut pe interferon, a cărui eliberare va interfera cu virusul bolii veziculoase a porcului. Pentru izolarea virusului sunt adăugate numai antibiotice, în vederea menţinerii mediului. Pentru diagnosticul diferential faţă de febra aftoasa trebuie, de asemenea, să fie inoculate celule tiroidiene primare de bovine sau celule renale de pui de hamster (BHK-21).3. Dacă se dezvolta un efect citopatic, fluidul supernatant trebuie să fie prelevat din culturile pozitive, atunci când efectul este complet, şi utilizat în testul ELISA pentru identificarea virusului. Culturile negative trebuie să fie inoculate pe culturi de tesut proaspăt de 48 sau 72 de ore, iar acest pasaj orb trebuie examinat după 72 de ore. În absenta efectului citopatic, după un pasaj orb ulterior proba poate fi declarata negativa pentru prezenta virusului viu.4. Suspensii de probe de fecale pot fi procesate ca în descrierea de la pct. 1. Deoarece în general exista mai puţin virus în fecale decât în epiteliu, este esenţial ca în absenta unui efect citopatic la primele doua pasaje să fie inclus un al treilea pasaj orb.5. Inocularea simultană a unei linii celulare porcine şi a unuia dintre sistemele de cultura de tesut menţionat mai sus - de preferat celule tiroidiene bovine primare - este un ghid util pentru a determina dacă probele veziculare conţin virusul bolii veziculoase a porcului sau virusul febrei aftoase care, ca şi în primul sistem, se va dezvolta numai în celule de origine porcina. Totuşi culturile de virus al febrei aftoase, cu o istorie îndelungată de transmitere între porci, pot, de asemenea, să se dezvolte, de preferinta, în sistemele de culturi celulare de origine porcina.C. Reactia de polimerizare în lant pentru depistarea genomului (PCR)1. Metode de recunoaştere a acidului nucleic pot fi utilizate pentru a detecta genomul viral al bolii veziculoase a porcului în materialul clinic şi care foloseşte tehnica PCR pentru a stabili legăturile dintre tulpinile de virus al bolii veziculoase a porcului, prin determinarea secventei de nucleotide a unei părţi de genom. Tehnici care folosesc PCR au fost perfectate pentru a se îmbunătăţi sensibilitatea diagnosticului. Au fost descrise proceduri de PCR-RT uşor diferite, folosind primeri care corespund unor regiuni intens conservate din genele 1C şi 1D ale genomului viral.2. Tehnica PCR este rapida - rezultatele sunt de obicei disponibile în 24 de ore - şi se detecteaza toate genotipurile de virus al bolii veziculoase a porcului, fiind suficient de sensibila pentru a se utiliza la prelevarea probelor de la cazurile suspecte clinic de boala.3. Atunci când este suspectata infectia subclinica sau atunci când probele sunt colectate după dispariţia bolii clinice ori când este necesară procesarea probelor de fecale, tehnicile PCR-RT perfectionate, asemănătoare PCR-RT secventiale, PCR-imun, PCR-ELISA şi metode mai elaborate de extracţie a ARN, care produc un sistem de detectare cel puţin la fel de sensibil, dar considerabil mult mai rapid decât pasajul multiplu pe cultura de tesut.4. Prin secventarea a aproximativ 200 de nucleotide din cadrul genei 1D care codifica proteina structurală majoră VP1 este posibila gruparea tulpinilor virusului bolii veziculoase a porcului, conform omologiei lor de secventa, precum şi a tulpinilor înrudite epidemiologic şi care provoacă boli în regiuni diferite sau la perioade diferite.D. Evaluarea rezultatelor testelor virusologice1. Detectarea de antigene sau de genom al virusului bolii veziculoase a porcului prin metodele ELISA sau PCR are aceeaşi valoare de diagnostic ca şi izolarea virusului.2. Totuşi izolarea virusului trebuie să fie considerată ca test de referinţa şi trebuie să fie utilizata ca test de confirmare, dacă este necesar, în special dacă un rezultat pozitiv ELISA sau PCR nu este asociat cu: a) detectarea de semne clinice ale bolii; b) detectarea de porci seropozitivi; sau c) o legătură epizootologica directa cu un focar confirmat.  +  Capitolul 8 Principii şi aplicaţii ale testelor serologice şi evaluarea rezultatelor acestoraA. Test de neutralizare a virusului (VN)1. Microtestul cantitativ de virus neutralizare (VN) pentru detectarea anticorpilor indusi de virusul bolii veziculoase a porcului este efectuat pe celule IB-RS-2 sau pe un sistem de celule echivalent, în plăci de microtitrare cu fundul lat din categoria cu cultura de tesut.2. Virusul este crescut în monostraturi de celule IB-RS-2 şi depozitat fie la -20°C după adăugarea de glycerol 50%, fie la -70°C fără glycerol. Serurile sunt inactivate înaintea testarii la 56°C timp de 30 de minute.B. ELISA1. Testul ELISA pentru detectarea anticorpilor este un test competitiv bazat pe anticorpi monoclonali. Dacă proba de ser conţine anticorpi ai virusului bolii veziculoase a porcului, legătură unor anticorpi monoclonali selectaţi, conjugati cu peroxidaza, cu antigenul virusului bolii veziculoase a porcului va fi inhibata. În acest test ELISA antigenul viral al bolii veziculoase a porcului este blocat în faza solida, folosindu-se anticorpi monoclonali, apoi probele de ser sunt incubate în dilutie corespunzătoare, urmată de adăugarea anticorpului monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior inhibitia legăturii anticorpului monoclonal cu antigenul bolii veziculoase a porcului este masurata prin intermediul unui substrat şi al unui cromogen.2. Un test ELISA indirect de blocare, care foloseşte anticorpi monoclonali izotipi specifici pentru a se detecta IgG sau IgM specifică porcului contra virusului bolii veziculoase a porcului, este util pentru evaluarea timpului de la infectia porcilor sau de la contaminarea spaţiilor infectate. În cazul acestui test ELISA izotipul specific antigenului viral este blocat în faza solida, folosindu-se un anticorp de captare a antigenului. Dacă proba de ser conţine anticorpi pentru virusul bolii veziculoase a porcului, aceştia sunt detectati folosindu-se o IgG antiporc sau o IgM antiporc monoclonal conjugat cu peroxidaza. Ulterior aceasta legătură este masurata prin intermediul unui substrat şi al unui cromogen.Testul ELISA izotip specific poate fi util, de asemenea, pentru deosebirea reactantului unic de adevaratii porci pozitivi, asa cum prevede lit. C.C. Aplicarea testelor serologice şi evaluarea rezultatelor1. Testul de VN şi testul ELISA sunt teste serologice recomandate. Cap. X enumera serurile de referinţa care sunt disponibile la laboratorul de referinţa comunitar, pentru a standardiza testele serologice efectuate în Comunitatea Europeană. Testul de VN trebuie să fie considerat ca test de referinţa, dar are dezavantajul ca se finalizează în 2 sau 3 zile şi necesita facilităţi pentru culturi celulare. Testul ELISA este mult mai rapid şi poate fi mult mai uşor standardizat. Testul ELISA de competiţie cu anticorpi monoclonali este cel mai fiabil. Testul ELISA descris până în prezent, utilizând anticorpi ai bolii veziculoase a porcului, este recomandat ca test de screening pentru un număr mare de probe. Totuşi testul de VN trebuie să fie utilizat ca test de confirmare, dacă este necesar, în special după prima detectare de probe pozitive într-o exploatatie. Porcii pozitivi la testul ELISA, dar negativi la testul de VN, pot fi omisi.2. Prezenta unui reactant unic*2) poate fi suspectata atunci când este detectat un singur porc seropozitiv şi când sunt îndeplinite următoarele criterii: a) nu exista semne clinice de boala în exploatatie; b) nu exista un istoric relevant al bolii clinice în exploatatie; c) nu exista antecedente de contact cu un focar de boala.3. Un porc este confirmat drept reactant unic atunci când: a) după testare nu sunt identificati alţi porci seropozitivi; b) prelevarea de probe efectuată la porcii de contact după prima detectare a reactantului unic nu indica seroconversie; c) titrul de anticorpi pentru o prelevare de probe repetată rămâne constant sau deviaza.4. Totuşi următoarele criterii şi principii suplimentare trebuie, de asemenea, să fie luate în considerare pentru confirmarea unui reactant unic: a) reactantii unici apar cu o prevalenta de aproximativ 1 per 1.000 de porci; b) serurile de la reactantii unici au, în general, următorul profil: titrul anticorpilor scăzut la testul de VN, linia de granita pozitiva la testul ELISA de competiţie pe bază de anticorpi monoclonali, nici o IgM şi nici o IgG la testul ELISA izotip specific pentru boala veziculoasa a porcului*3).  +  Capitolul 9 Semne clinice şi particularităţi ale bolii veziculoase a porcului1. Boala veziculoasa a porcului este o boala contagioasa a porcilor, produsă de un enterovirus din familia Picornaviridae care poate evolua sub forma veziculoasa subclinica, uşoară sau severă, ce depinde de tulpina de virus implicata, de calea şi doza infectanta, precum şi de condiţiile de creştere în care au fost ţinuţi porcii. Factorii de stres suplimentari, precum transportul, aglomerarea cu alţi porci şi temperaturile extreme, pot, de asemenea, predispune la dezvoltarea semnelor clinice.2. Boala se caracterizează printr-o febra uşoară şi apariţia de vezicule pe bureletul coronarian, pe protuberantele calcaielor, pe pielea membrelor şi mai puţin frecvent pe rat, buze, limba şi mameloane. Rata morbiditatii poate fi până la 100%, iar mortalitatea este foarte scăzută sau nulă.3. Infectia se poate dezvolta sub o formă inaparenta sau uşoară care prezintă doar o afectare tranzitorie în starea generală a porcilor şi care conduce la dezvoltarea de anticorpi ce neutralizeaza virusul în câteva zile*4). Din cauza naturii subclinice sau uşoare a bolii, aceasta este deseori suspectata prima, ca urmare a testelor serologice pentru supravegherea bolii sau pentru certificarea exportului. Focarele europene recente de boala veziculoasa a porcului au fost caracterizate prin semne clinice mai puţin severe sau chiar fără semne clinice, diagnosticul fiind frecvent dependent de testele serologice. Totuşi semnele clinice ale bolii veziculoase a porcului nu se pot deosebi de cele ale febrei aftoase. Orice forma veziculara trebuie să fie tratata iniţial ca suspecta de febra aftoasa, iar diagnosticul diferential trebuie să fie efectuat cat mai curând posibil.──────────────*2) O proporţie mica de reactant unic poate fi detectata prin orice test serologic curent utilizat pentru boala veziculoasa a porcului. Factorii responsabili pentru reactantii unici sunt necunoscuţi.Reactivitate serologica incrucisata cu virusul bolii veziculoase a porcului poate aparea datorită infectarii cu un alt picornavirus încă neidentificat sau poate fi datorat altor factori nespecifici prezenţi în ser.*3) IgG specifică singura sau atât IgG, cat şi IgM sunt de obicei detectate în probe de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului, întrucât serul de la reactantii unici conţine în general numai IgM. IgG nu va fi detectata în probele de ser de la porcii infectati cu virusul bolii veziculoase a porcului într-o perioadă de până la 10 sau 14 zile. Totuşi IgG specifică va fi detectata în a doua proba de sânge. Porcii infectati recent nu pot fi deosebiţi în mod sigur de reactantii unici înainte ca răspunsul imun al acestora să se modifice de la producerea de IgM la cea de IgG. A se vedea, de asemenea, şi nota de subsol*4).4. Perioada de incubaţie a bolii veziculoase a porcului la porcii individuali este, de obicei, între 2 şi 7 zile, după care urmează febra pasagera de până la 41°C, dar semnele clinice pot deveni evidente în exploatatie după o perioadă mai lungă. Veziculele se dezvolta apoi pe bureletul coronarian, în special la jonctiunea cu onglonul. Acestea pot afecta întregul burelet coronarian şi provoacă pierderea copitei. Mult mai rar veziculele pot, de asemenea, să apară pe rat, în special pe suprafaţa dorsala, pe buze, pe limba şi pe mameloane, iar eroziuni de dimensiuni mici pot fi observate pe genunchi. Porcii afectaţi pot schiopata şi pot refuza hrana. Porcii mai tineri sunt mult mai sever afectaţi, deşi mortalitatea datorată bolii veziculoase a porcului este foarte rara, în contrast cu febra aftoasa, la efectivul tânăr.5. Au fost raportate semne nervoase, dar acestea sunt neobisnuite. Avortul nu este o caracteristica tipica a bolii veziculoase a porcului. Insuficienta cardiaca datorată miocarditei multifocale poate fi o caracteristica a febrei aftoase şi a encefalomiocarditei, în special la purceii tineri, dar nu apare în boala veziculoasa a porcului.6. Vindecarea este de obicei completa în 2 sau 3 săptămâni, singura evidenta a infectiei fiind o linie orizontala, întunecată pe copita, acolo unde creşterea onglonului a fost întreruptă temporar.7. Porcii afectaţi pot excreta virusul prin orificiile nazale şi pe gura şi prin fecale, cu 48 de ore înainte de apariţia semnelor clinice. Cea mai mare cantitate de virus este eliminata în primele 7 zile după infectie, iar excretia de virus prin orificiile nazale şi pe gura se opreşte, în mod normal, după doua săptămâni. Virusul poate fi izolat din fecale până la 20 de zile după infectie, deşi a fost raportată prezenta sa până la 3 luni. Acesta poate persista pentru o perioadă considerabila în tesutul necrotic asociat cu vezicule rupte şi în fecale.  +  Capitolul 10 Seruri de referinţa pentru boala veziculoasa a porcului
           
      Ser de referinţăOrigineComentarii5)
      1Ser normal de porcSer5) de control negativ
      2Ser colectat la 21 de zile după infecţie (dpi) de la porci infectaţi cu tulpina virusului bolii veziculoase a porcului UKG 27/72Ser de control intens pozitiv
      3Diluţie A 1:10 în NPS a unui ser colectat după 5 dpi de la Un porc infectat cu tulpină bolii veziculoase a porcului 8/94/Italiaun ser slab pozitiv prelevat de la un porc imediat după infecţie cu o tulpina de virus europeană recentă a bolii veziculoase a porcului. Serul a fost diluat pentru a da un rezultat slab pozitiv la testul ELISA şi la testul de VN
      4Diluţie de A 1:40 a unui ser colectat la 21 dpi de la Un porc infectat cu tulpina virusului bolii veziculoase a porcului UKG 27/72un ser slab pozitiv care defineşte nivelul cel mai scăzut de anticorpi pe care laboratoarele naţionale de referinţă ale Uniunii Europene ar trebui să îl evidenţieze ca fiind consistent pozitiv prin metoda ELISA şi prin metoda de neutralizare a virusului. Echivalent pentru ser RS 01-04-946)
      5Ser colectat la 4 dpi de la un porc infectat cu tulpina virusului bolii veziculoase a porcului UKG 27/72Un ser slab pozitiv prelevat de la un porc imediat după infecţie
      6Ser colectat la 5 dpi de la un porc infectat cu tulpina virusului bolii veziculoase a porcului UKG 27/72Un ser slab pozitiv prelevat de la un porc imediat după infecţie
    *4) IgM specifica poate fi, de obicei, detectată în sânge de la 2 la 3 zile după infecţie şi dispare după 30 până la 50 de zile. IgG specifica poate fi, de obicei, detectată în sânge de la 10 la 14 zile după infecţie şi persistă cel puţin pentru câţiva ani. Ig izotip poate fi determinată prin intermediul testului ELISA descris la cap. VIII lit. B pct. 2.*5) Comentarii cu privire la testarea porcilor individuali. Pentru supravegherea serologică sensibilitatea testului folosit trebuie să fie luată în considerare.*6) De exemplu, un ser cu un titru suficient mai crescut decât limita la care acesta este evaluat ca fiind întotdeauna pozitiv prin metoda ELISA şi prin testul de VN la testarea repetată.──────────────────