NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ din 26 februarie 2007care stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conţinutul de aflatoxină B(1)
EMITENT
  • AUTORITATEA NAŢIONALĂ SANITARĂ VETERINARĂ ŞI PENTRU SIGURANŢA ALIMENTELOR
  • Publicat în  MONITORUL OFICIAL nr. 236 din 5 aprilie 2007



     +  Articolul 1Analizele pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conţinutul acestora de aflatoxină B(1) trebuie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexa la prezenta normă sanitară veterinară.  +  Articolul 2Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor informează Comisia Europeană cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare.  +  Anexă------la norma sanitară veterinară----------------------------DETERMINAREA AFLATOXINEI B(1)A. Metodă cromatografică monodimensională în strat subţire1. Domeniu şi scopMetoda se utilizează pentru determinarea nivelului de aflatoxină B(1) din materii prime şi furaje simple. Metoda poate fi aplicată numai dacă în conţinutul acestora nu se găseşte pulpă de citrice. Limita inferioară a determinării este 0,01 mg/kg (10 ppb).În prezenţa substanţelor interferente, este necesară repetarea analizei utilizându-se metoda B (metoda cromatografică de înaltă performanţă în fază lichidă).2. Principiul metodeiProba se supune extracţiei cu cloroform. Extractul se filtrează şi o porţiune alicotă este preluată şi purificată pe coloana cromatografică cu silicagel. Eluatul se evaporă şi reziduul se redizolvă într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen şi acetonitril.O porţiune alicotă din această soluţie se analizează prin cromatografie în strat subţire (CSS). Cantitatea de aflatoxină B(1) se determină, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, fie prin comparare cu cantităţi cunoscute de aflatoxină standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasă din furaj trebuie să fie confirmată prin procedura indicată.3. ReactiviNB: Toţi reactivii trebuie să fie de calitate "pentru analiză " numai în cazul în care nu s-a stabilit altfel.3.1. Acetonă3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 până la 1,0% etanol 96% (v/v)3.3. n-hexan3.4. Metanol3.5. Eter dietilic anhidru, fără peroxizi3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2(v/v)3.7. Amestec de cloroform (pct. 3.2) şi metanol (pct. 3.4) 97/3(v/v)3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografică, mărimea granulei 0,05 până la 0,20 mm3.9. Vată de bumbac absorbantă, degresată anterior cu cloroform, sau vată de sticlă3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granule3.11. Gaz inert, de exemplu azot3.12. Acid clorhidric 1 N3.13. Acid sulfuric 50%(v/v)3.14. Diatomit (hyflosupercel), spălat în acid3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS3.16. Soluţie standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxină B(1) per ml preparată în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6), preparat şi verificat aşa cum s-a indicat la secţiunea 7.3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare calitativă ce conţine aproximativ 0,1 g aflatoxină B(1) şi B(2) per ml în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6). Aceste concentraţii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încât să se obţină aceeaşi intensitate de fluorescenţă pentru ambele aflatoxine.3.18. Solvenţi de developare:3.18.1. Cloroform (pct. 3.2)/acetonă (pct. 3.1): 9/1(v/v), soluţie-mamă nesaturată;3.18.2. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3.4)/apă: 96/3/1(v/v/v), soluţie-mamă nesaturată;3.18.3. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3/4)/apă: 94/4,5/1,5(v/v/v), soluţie-mamă saturată;3.18.4. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 94/6(v/v), soluţie-mamă saturată;3.18.5. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 97/3(v/v), soluţie-mamă saturată;4. Aparatură4.1. Râşniţă-mixer4.2. Aparat de agitat sau agitator magnetic4.3. Hârtie de filtru cutată, Schleicher şi Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm.4.4. Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml4.5. Rotovapor, prevăzut cu un balon cu fund rotund de 500 ml4.6. Balon conic de 500 ml, cu buşon rodat de sticlă4.7. Aparatură pentru CSS4.8. Plăci de sticlă pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate după cum urmează (cantităţile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci plăci): se pun 30 g silicagel G-HR (3.15) într-un balon conic; se adaugă 60 ml apă, se astupă şi se agită timp de un minut. Se împrăştie suspensia pe plăci astfel încât să se obţină un strat uniform de grosime 0,25 mm; se lasă să se usuce la aer şi apoi se depozitează într-un exicator ce conţine silicagel. În momentul utilizării, se activează plăcile prin ţinerea acestora în cuptor la 110°C timp de o oră.4.9. Lampă UV cu lungime de undă lungă (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie să facă posibilă, pentru un spot de 1 ng de aflatoxină B(1), distingerea cu claritate pe o placă CSS la o distanţă de 10 cm de lampă.4.10. Eprubete gradate de 10 ml cu dopuri de polietilenă4.11. Spectrofotometru UV4.12. Fluorodensitometru (opţional)5. Procedură5.1. Prepararea probei (vezi "Observaţii", partea C, pct. 1).Se macină proba astfel încât întreaga cantitate să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm (în conformitate cu recomandarea ISO R 565).5.2. ExtracţieSe pun 50 g de probă măcinată, omogenizată într-un tub conic de 500 ml. Se adaugă 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apă şi 250 ml de cloroform (pct. 3.2). Se astupă balonul, se agită timp de 30 de minute cu aparatul (4.2) şi se filtrează printr-o hârtie de filtru cutată (pct. 4.3). Se înlătură primii 10 ml din filtrat şi apoi se colectează 50 ml.5.3. Curăţarea coloaneiSe introduce în capătul inferior al unui tub de cromatografie (pct. 4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (pct. 3.9), se umplu două treimi din tub cu cloroform (pct. 3.2) şi se adaugă 5 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10).Se verifică dacă suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu este netedă, apoi se adăugată 10 g de silicagel (pct. 3.8) în porţiuni mici. Se agită cu atenţie după fiecare adăugare, pentru a elimina bulele de aer. Se lasă în repaus timp de 15 minute şi apoi se adaugă cu atenţie 15 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10). Se lasă lichidul să curgă până când acesta ajunge deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu.Se amestecă 50 ml de extract colectat (pct. 5.2) cu 100 ml de n-hexan (pct. 3.3) şi se transferă cantitativ amestecul pe coloană. Se lasă lichidul să curgă până când acesta este exact deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Lichidul colectat se elimină. Apoi se adaugă 100 ml de eter dietilic (pct. 3.5) şi se lasă din nou să curgă până la suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu. În timpul acestor operaţiuni debitul trebuie să fie de 8 până la 12 ml per minut şi coloana nu trebuie să se usuce. Se elimină lichidul care curge. Se eluează apoi cu 150 ml amestec de cloroform/metanol (pct. 3.7) şi se colectează întregul eluat. Acesta se evaporă până aproape de uscare la o temperatură ce nu depăşeşte 50°C şi sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) cu rotovapor (pct. 4.5). Se transferă cantitativ reziduul, utilizându-se cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen-acetonitril (pct. 3.6), într-o eprubetă gradată de 10 ml (pct. 4.10). Se concentrează soluţia sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) şi apoi se ajustează volumul până la 2 ml cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6).5.4. Cromatografia în strat subţirePe placa cromatografică (pct. 4.8) se aplică spoturi, la 2 cm de la marginea inferioară, la intervale de 2 cm, cu volumele indicate mai jos din soluţia standard şi din extract: a) 10, 15, 20, 30 şi 40 æl din soluţia standard de aflatoxină B(1) (pct. 3.16); b) 10 æl din extractul obţinut la pct. 5.3 şi, suprapunându-se pe acelaşi punct, 20 æl de soluţie standard (3.16); c) 10 şi 20 æl de extras obţinut la pct. 5.3.Se developează cromatograma la întuneric folosind unul din solvenţii de developare (pct. 3.18). Alegerea solventului trebuie să fie efectuată în prealabil, prin depozitarea a 25 æl de soluţie standard calitativă (pct. 3.17) pe placă. Atunci când se developează cromatograma la întuneric, aflatoxinele B(1) şi B(2) trebuie să fie complet separate.Solvenţii se lasă să se evapore la întuneric, după care placa cromatografică plasată la 10 cm de lampă (pct. 4.9) se iradiază cu UV. Spoturile de aflatoxină B(1) dau o fluorescenţă albastră.5.5. Determinări cantitativeSe determină fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, aşa cum este indicat mai jos.5.5.1. Măsurători vizualeSe determină cantitatea de aflatoxină B(1) din extract, prin compararea intensităţii fluorescenţei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluţiei standard. Dacă este necesar, se interpolează. Fluorescenţa obţinută prin suprapunerea extractului din soluţia standard trebuie să fie mai intensă decât cea a cantităţii de 10 æl de extract şi trebuie să fie mai mică decât un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescenţei dată de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decât cea de 40 æl din soluţia standard, se diluează extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subţire.5.5.2. Măsurători prin fluorodensitometrieIntensitatea fluorescenţei spoturilor de aflatoxină B(1) se măsoară cu fluorodensitometru (pct. 4.12), la o excitaţie cu lungime de undă de 365 nm şi o emisie cu lungime de undă de 443 nm. Cantitatea de aflatoxină B(1) din spoturile de extract se determină prin compararea intensităţilor fluorescenţei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxină B(1) standard.5.6. Confirmarea identităţii aflatoxinei B(1)Confirmarea identităţii aflatoxinei B(1) din extract se efectuează prin procesele indicate mai jos.5.6.1. Tratare cu acid sulfuricSe pulverizează acid sulfuric (pct. 3.13) pe cromatograma obţinută la pct. 5.4. Fluorescenţa spoturilor de aflatoxină B(1) trebuie să se schimbe, sub iradierea UV, din albastră în galbenă.5.6.2. Cromatografie bidimensională implicând formarea de aflatoxină B(1) -hemiacetat (aflatoxină B(2a))NB: Operaţiunile descrise mai jos trebuie să fie efectuate urmând cu atenţie diagrama din figura 3.5.6.2.1. Aplicarea soluţiilorPentru a preveni migrarea fronturilor solventului se trasează pe o placă (pct. 4.8) două linii drepte paralele la două părţi marginale (6 cm de fiecare parte). Se marchează soluţiile următoare pe placă utilizându-se pipete capilare sau microseringi:- în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obţinută la pct. 5.3, conţinând aproximativ 2,5 nm aflatoxină B(1);- în punctele B şi C: 25 æl de soluţie standard (pct. 3.16).5.6.2.2. DevelopareSe developează cromatograma în direcţia I, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamă nesaturată) până când frontul de solvent atinge linia limită a solventului.Se îndepărtează soluţia-mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la întuneric, la temperatura ambiantă, timp de 5 minute. Se pulverizează apoi cu acid clorhidric (pct. 3.12) de-a lungul unei benzi de 2,5 cm înălţime, ce acoperă punctele A şi B (indicată prin zona haşurată în figura 3) până se înnegreşte, protejând restul plăcii cu o foaie de sticlă. Se lasă să reacţioneze timp de 10 minute la întuneric şi se usucă cu un curent de aer la temperatură ambiantă.Se developează apoi cromatograma în direcţia II, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie-mamă nesaturată) până când frontul de solvent ajunge la linia limită a solventului. Se îndepărtează soluţia-mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la temperatura ambiantă.5.6.2.3. Interpretarea cromatogrameiSe examinează cromatograma sub lumină UV (pct. 4.9) şi se verifică următoarele caracteristici: a) apariţia unui spot albastru de aflatoxină B(1) ce provine de la soluţia standard aplicată în punctul C (migrare în direcţia I); b) apariţia unui spot fluorescent albastru de aflatoxină B(1) (nu reacţionează cu acid clorhidric) şi un spot fluores-cent albastru mai intens de aflatoxină B(1) -hemiacetat, ambele originare din soluţia standard aplicată în punctul B (migrarea în direcţia II); c) apariţia de spoturi asemănătoare celor descrise la lit. b) ce provin din extractul din proba aplicată în punctul A. Poziţia acestor spoturi este definită mai întâi prin distanţa de migrare a aflatoxinei B(1) de la punctul A în direcţia I (aceeaşi ca aceea lucrată prin standardul aplicat la C) şi apoi prin distanţele de migrare de acolo în direcţia II a aflatoxinei B(1) -hemiacetat (aceeaşi ca acelea lucrate prin standardul aplicat la B). Intensităţile fluorescenţei spoturilor hemiacetate ce provin din extract şi din standardul aplicat în punctul B trebuie să se potrivească.6. Calcularea rezultatelor6.1. De la măsurătorile vizualeConţinutul în micrograme de aflatoxină B(1) per kg de probă (ppb) se determină utilizând următoarea formulă:                 C x Y x V                ----------,                  m x Xîn care:Y şi X = volumele în microlitri ale soluţiei standard de aflatoxină B(1) (pct. 3.16) şi ale extractului având o intensitate a fluorescenţei similară;C = concentraţia în micrograme de aflatoxină B(1) per ml în soluţia standard (pct. 3.16);V = volumul final al extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesară;m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curăţarea coloanei.6.2. De la măsurătorile fluorodensitometriceConţinutul în micrograme de aflatoxină B(1) per kg de probă se determină utilizând următoarea formulă:               C x V             -------,              m x Yîn care:Y = volumul în microlitri de extract depus pe placă (10 sau 20 l);C = cantitatea în nanograme de aflatoxină B(1) din spotul de extras (proporţional valorii Y luate), dedusă din măsurători;V = volumul final al extractului în microlitri, permiţând orice diluţie ce a fost necesară;m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curăţarea coloanei.7. Prepararea şi testarea soluţiei standard (pct. 3.16)7.1. Determinarea concentraţiei de aflatoxină B(1)Se prepară o soluţie standard de aflatoxină B(1) în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) cu o concentraţie de 8 la 10 æg/ml.Se determină spectrul de absorbţie între lungimile de undă de 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.11).Se măsoară densitatea optică (A) la lungimea de undă de 363 nm, în cazul soluţiei de cloroform, sau la lungimea de undă de 348 nm, în cazul soluţiei de amestec de benzen/acetonitril.Pentru soluţia de cloroform, concentraţia în micrograme de aflatoxină B(1)/ml de soluţie se calculează utilizând formula:               312 x A x 1.000              ---------------- .                   20.600Pentru soluţia formată din amestecul benzen/acetonitril, concentraţia în micrograme de aflatoxină B(1) /ml de soluţie se calculează utilizând formula:               312 x A x 1.000              --------------- .                  19.800Se diluează după cum este corespunzător, ferit de lumina zilei, pentru a obţine o soluţie de lucru standard, cu o concentraţie de aflatoxină B(1) de aproximativ 0,1 æg/ml. Această soluţie este stabilă timp de două săptămâni dacă se păstrează într-un refrigerator la 4°C.7.2. Testarea purităţii cromatograficeSe depun pe o placă (pct. 4.8) 5 æl soluţie standard de aflatoxină B(1) ce conţine 8 până la 10 æg/ml (pct. 7.1). Se developează cromatograma aşa cum s-a indicat la pct. 5.4. În lumina UV cromatograma trebuie să indice numai un spot şi nu trebuie să fie perceptibilă în zona de depozitare originală nicio fluorescenţă.8. RepetabilitateDiferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, prin aceeaşi analiză, trebuie să fie de maximum:- 25%, corelată cu rezultatul cel mai mare pentru un conţinut de aflatoxină B(1) de la 10 şi până la 20 æg/kg;- 5 æg, în valoare absolută, pentru un conţinut mai mare de 20 şi până la 50 æg/kg;- 10%, corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 50 æg/kg.9. ReproductibilitateA se vedea "Observaţii", partea C, pct. 2.B. Metoda cromatografică de înaltă performanţă în fază lichidă (HPLC)1. Domeniu şi scopMetoda se utilizează pentru determinarea nivelului de aflatoxină B(1) din furaje, incluzându-le şi pe cele care conţin pulpă de citrice. Limita inferioară a determinării este 0,001 mg/kg (1ppb).2. PrincipiuProba se supune extracţiei de cloroform. Extractul se filtrează şi o parte alicotă se purifică printr-un cartuş de florisil şi apoi printr-un cartuş C(18). Separarea finală şi determinarea sunt realizate cu ajutorul metodei cromatografice de înaltă performanţă în faza lichidă (HPLC), utilizând faza inversă cu coloană C(18), urmată de derivatizare postcoloană cu iod în apă şi detectare fluorescentă.Deoarece micotoxinele sunt substanţe extrem de toxice, manipularea trebuie să fie efectuată într-un spaţiu cu abur şi trebuie luate precauţii speciale în cazul în care toxinele sunt în formă uscată datorită caracterului electrostatic al acestora şi tendinţei de a se dispersa în mediul de lucru.3. Reactivi3.1. Cloroform, stabilizat cu etanol 0,5 până la 1%, din masă. A se vedea observaţia pct. 10.2;3.2. Metanol pentru HPLC;3.3. Acetonă;3.4. Acetonitril pentru HPLC;3.5. Solvenţi pentru eluare: se prepară cu o zi înainte sau îndepărtaţi ultrasonic aerul din solvenţi.3.5.1. Amestec de acetonă (pct. 3.3) şi apă, 98 + 2(v + v).3.5.2. Amestec de apă şi metanol (pct. 3.2), 80+20(v+v).3.5.3. Amestec de apă şi acetonă (pct. 3.3), 85+15(v+v).3.6. Faza mobilă pentru HPLCAmestec de apă, metanol (pct. 3.2) şi acetonitril (pct. 3.4), 130+70+40(v+v+v).NB: Compoziţia solventului pentru faza mobilă poate avea nevoie să fie ajustată în funcţie de coloana HPLC folosită.3.7. Soluţie de iod saturată: se adaugă 2 g la 400 ml apă. Se amestecă cel puţin 90 min. şi se filtrează printr-o membrană filtrantă (pct. 4.15). Se protejează de lumină pentru a preveni fotodegradarea.3.8. Celit 545 spălat în acid sau echivalent3.9. Cartuş de florisil (ape SEP-PAK) sau echivalent3.10. Cartuş C(18)(ape SEP-PAK) sau echivalent3.11. Gaz inert, de exemplu azot3.12. Aflatoxină B(1) soluţie standard în cloroform, concentraţie 10 æg/ml. Se verifică concentraţia soluţiei, după cum urmează: se determină spectrumul de absorbţie a soluţiei între 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.23). Se măsoară absorbanţa (A) la un maxim aproape de 363 nm. Se calculează concentraţia de aflatoxină B(1) în micrograme per mililitru de soluţie, utilizând formula:                             312 x A x 1.000    Concentraţia (emg/ml) = ----------------- = 13,991 x A                                 22.3003.12.1. Aflatoxină B(1) soluţie pastă standard în cloroformSe transferă cantitativ 2,5 ml aflatoxină B(1) soluţie standard (pct. 3.12) într-un balon cotat de 50 ml şi se aduce la semn cu cloroform (pct. 3.1). Se depozitează soluţia într-un loc răcoros (4°C), întunecat, bine sigilat şi învelit în folie de aluminiu.3.13. Aflatoxină B(1) soluţii de calibrare HPLCNB: Pentru pregătirea soluţiilor se foloseşte sticlă spălată cu acid (a se vedea pct. 4, Aparatură).3.13.1. Soluţie calibrare 4 ng/mlSe lasă balonul cotat cu soluţie standard (pct. 3.12.1) în folia de aluminiu să se încălzească la temperatura camerei (câteva ore). Se transferă cei 400 æl soluţie pastă standard (200 ng aflatoxină B1) într-un balon cotat de 50 ml şi se evaporă până la uscare într-un curent de gaz inert (pct. 3.11).Se dizolvă reziduul obţinut în aproximativ 20 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3.), se adaugă amestec apă/acetonă până la semn şi se amestecă bine.3.13.2. Soluţie pentru calibrare 3 ng/mlSe transferă cantitativ 7,5 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se amestecă bine.3.13.3. Soluţie pentru calibrare 2 ng/mlSe transferă cantitativ 25 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 50 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se amestecă bine.Această soluţie este, de asemenea, indicată ca standard de referinţă, pentru a fi utilizată în cazul injectărilor repetitive în timpul HPLC (pct. 5.5).3.13.4. Soluţie pentru calibrare 1 ng/mlSe transferă cantitativ 2,5 ml soluţie de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 10 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se omogenizează.3.14. Fiolă conţinând amestec de aflatoxine B1, B2, G1 şi G2 cu concentraţia aproximativă de 1, 0,5, 1 şi, respectiv, 0,5 æg/ml în 1 ml cloroform3.14.1 Soluţie pentru test cromatograficSe transferă conţinutul fiolei (pct. 3.14) într-un flacon cu opritor din sticlă sau cu capac cu filet. Se transferă 40 æl soluţie în tubul de test cu opritor din sticlă (clătit cu acid) (pct. 4.22). Se evaporă cloroformul în curent de gaz inert (3.11) şi se dizolvă din nou în 10 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3).3.15. Reactivi pentru testul de confirmare (6)3.15.1. Soluţie saturată de clorură de sodiu3.15.2. Sulfat de sodiu, anhidru, granulat4. AparaturăAtenţie! Utilizarea sticlei fără a fi spălată cu acid pentru soluţii apoase de aflatoxină poate cauza pierderi. Trebuie să fie acordată atenţie deosebită obiectelor din sticlă noi şi celor de unică folosinţă, precum şi flacoanelor autoprelevatoare şi pipetelor Pasteur. Obiectele de laborator din sticlă ce au intrat în contact cu soluţii apoase de aflatoxină trebuie să fie lăsate câteva ore în acid slab (de exemplu acid sulfuric = 2 mol/l), iar apoi trebuie să fie clătite cu apă distilată, pentru a se îndepărta toate urmele de acid (de exemplu de trei ori, verificare cu hârtie pH). În practică, acest tratament este necesar pentru baloanele cu fund rotund (pct. 4.4), baloane cotate, cilindri de măsurare, flacoane sau tuburi folosite pentru soluţii de calibrare şi extracte finale (în special flacoane pentru autoprelevare) şi pipete Pasteur, dacă acestea sunt folosite pentru transferul soluţiilor de calibrare sau al extractelor.4.1. Râşniţă-mixer4.2. Sită cu orificii de 1,0 mm, (ISO R 565)4.3. Agitator mecanic4.4. Evaporator rotativ în vacuum, echipat cu balon cu fund rotund de 150 până la 250 ml4.5. Injector pentru cromatografie cu lichid de înaltă performanţă cu deschidere potrivită pentru injecţia a 250 ml. A se urmări instrucţiunile producătorului pentru umplerea parţială sau completă a deschiderii.4.6. Coloană de analiză HPLC: pachet C(18) 3 æm sau 5 æm4.7. Pompă fără pulsaţie pentru reactiv post-coloană de iod4.8. Piesă în formă de T pentru volume moarte zero, inox (1/16" x 0,75 mm)4.9. Bobină spiralată de reacţie; teflon sau inox. Dimensiunile de 3000 x 0,5 mm până la 5000x0,5 mm sunt cele mai potrivite în combinaţie cu coloane HPLC de 5 æm sau 3 æm.4.10. Baie de apă controlată termostatic, ajustată la 60°C, cu posibilitate de reglare a temperaturii mai bună de 0,1°C4.11. Detector de fluorescenţă, cu excitaţia la lungime de undă 365 nm şi emisia la 435 nm. (Pentru instrument de filtrare: lungimea de undă a emisiei > 400 nm). Trebuie să fie posibilă detectarea a cel puţin 0,05 ng aflatoxină B(1) . Unele presiuni pot fi recomandate (de exemplu, reductor, bobină din teflon sau inox conectată la borna de ieşire a detectorului), pentru a suprima bulele de aer din celula de flux.4.12. Dispozitiv de înregistrare4.13. Integrator electronic (opţional)4.14. Hârtie filtru cutată cu diametrul de 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 sau echivalent4.15. Membrană filtrantă cu dimensiunea porilor de 0,45 æm, Millipore HAWP 04700 sau echivalent4.16. Balon conic de 500 ml cu opritor din sticlă4.17. Coloană din sticlă (diametru interior de aproximativ 1 cm, lungime de aproximativ 30 cm) echipat cu vârf Luer4.18. Robinet de închidere Luer rezistent la cloroform (de exemplu, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 sau echivalent)4.19. Seringă rezistentă chimic, racord Luer de 10 ml4.20. Seringă potrivită pentru injecţie HPLC de 250 æl (a se vedea pct. 4.5)4.21. Microseringă de 100 æl pentru prepararea soluţiilor de calibrare (se verifică prin cântărire ca precizia să fie de aproximativ 2%)4.22. Tuburi calibrate de 10 ml cu opritor din sticlă4.23. Spectrofotometru, potrivit pentru măsurători în regiunea spectrală UV4.24. Echipament pentru testul de confirmare (6)4.24.1. Pâlnie pentru separare de 100 æl cu robinet de închidere din teflon, spălată cu acid4.24.2. Bloc pentru încălzire, 40 până la 50°C5. Procedură5.1. Prepararea probeiSe macină proba până ce trece prin sită (pct. 4.2).5.2. Porţia pentru testSe cântăresc 50 g din proba preparată în balonul conic (pct. 4.16).5.3. ExtracţieSe adaugă la porţia pentru test 25 g celit (pct. 3.8), 250 ml cloroform (pct. 3.1) şi 25 ml apă. Se astupă balonul şi se agită 30 de minute cu un agitator mecanic (pct. 4.3). Se filtrează prin hârtie filtru cu caneluri (pct. 4.14). Se colectează 50 ml filtrat. Este necesară prelevarea unei alicote din filtrat şi diluarea până la 50 ml cu cloroform, astfel încât concentraţia de aflatoxină B(1) să nu fie mai mare de 4 ng/ml.5.4. Curăţare:Procedura trebuie să fie efectuată fără întreruperi semnificative.Atenţie!- laboratorul în care sunt făcute analizele trebuie protejat adecvat de lumina zilei prin utilizare de:(i) folie absorbantă UV pe ferestre în combinaţie cu lumină slabă (fără raze solare);(îi) perdele sau jaluzele în combinaţie cu lumină artificială (tuburile fluorescente sunt acceptate);- soluţiile ce conţin aflatoxină trebuie protejate de lumină şi este indicat a se păstra la întuneric utilizându-se folie de aluminiu.5.4.1. Purificare Florisil SEP-PAK5.4.1.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuşSe montează un robinet de închidere (pct. 4.18) la tija scurtă a cartuşului de florisil (pct. 3.9) (a se vedea figura 1). Se spală cartuşul şi se elimină aerul luând 10 ml cloroform (pct. 3.1) şi trecând repede 8 ml prin robinetul de închidere în cartuş, utilizând o seringă (pct. 4.19). Se montează tija lungă a cartuşului la coloana din sticlă (pct. 4.17) şi se trec cei 2 ml cloroform rămaşi prin cartuş în coloană. Se închide robinetul. Se extrage seringa.5.4.1.2. PurificareSe adaugă filtratul colectat la pct. 5.3 la ansamblul coloană-cartuş şi se lasă să se scurgă. Se spală cu 5 ml cloroform (pct. 3.1), apoi cu 20 ml metanol (pct. 3.2). Se îndepărtează eluatul. În timpul acestor operaţiuni, se asigură faptul că ansamblul coloană-cartuş nu se usucă.Se eluează aflatoxină B(1) cu 40 ml amestec acetonă-apă (pct. 3.5.1) şi se colectează întregul eluat în balonul cu fundul rotund al evaporatorului rotativ (pct. 4.4). Se concentrează eluatul pe evaporatorul rotativ la 40°C până la 50°C până ce nu se mai distilează acetona. (NB: În acest punct rămân în balon aproximativ 0,5 ml lichid. Experimentele au arătat că după acest punct evaporarea nu mai este necesară, şi atunci când rămâne o cantitate de lichid de 0,5 ml acetona nu reprezintă o cantitate semnificativă. Reziduurile de acetonă rămase pot cauza pierderi de aflatoxină B(1) la nivelul cartuşului C(18).) Se adaugă 1 ml metanol (pct. 3.2), se agită circular balonul pentru a dizolva aflatoxina B(1) pe lateralul balonului, se adaugă 4 ml apă şi se amestecă. Se deconectează şi se îndepărtează cartuşul. Se clăteşte coloana de apă şi se păstrează pentru etapa de purificare a cartuşului C(18).5.4.2. Purificare C(18) SEP-PAK5.4.2.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuşSe montează un robinet de închidere la tija scurtă a cartuşului C(18) (pct. 3.10) - figura 1. Se pregăteşte cartuşul şi se elimină orice bulă de aer prin trecerea rapidă cu o seringă (pct. 4.19) a 10 ml metanol (pct. 3.2) prin robinet în cartuş (Bulele de aer din cartuş se văd ca petele de lumină pe fond întunecat). Se iau 10 ml apă şi se trec 8 ml prin cartuş (A se evita pătrunderea aerului în cartuş în momentul înlocuirii metanolului cu apa). Se montează tija lungă a cartuşului la o coloană de sticlă (pct. 4.17) şi se trec cei 2 ml apă rămaşi prin cartuş în coloană. Se închide robinetul. Se extrage seringa.5.4.2.2. PurificareSe transferă cantitativ extractul colectat la pct. 5.4.1.2. în coloana de sticlă (pct. 4.17), spălând balonul cu 5 ml amestec apă/metanol (pct. 3.5.2.), lăsând să se scurgă. În timpul acestor operaţiuni se asigură faptul că ansamblul coloană-cartuş nu se usucă. (În momentul în care bulele de aer se strâng lângă cartuş se opreşte curgerea şi se îndepărtează partea de sus a coloanei de sticlă pentru a elimina bulele de aer. Se continuă.) Se elutează cu 25 ml amestec apă/metanol. Se elimină eluatul. Se elutează aflatoxina B(1) cu 50 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) şi se colectează tot eluatul într-un balon cotat de 50 ml. Se completează cu apă până la semn şi se amestecă: soluţia de test rezultată este utilizată pentru cromatografie (pct. 5.5).Atenţie! Filtrarea extractului final anterioară HPLC nu este obligatorie. Dacă se consideră necesar filtrele din celuloză nu trebuie să fie folosite deoarece pot produce pierderi de aflatoxină B(1) . Sunt acceptate filtrele din teflon.5.5. Cromatografia de înaltă performanţă cu lichid(A se vedea figura 2 pentru setarea echipamentului). A se lăsa suficient timp pentru condiţionarea şi stabilizarea instrumentelor.NOTA 1: Debitul de curgere dat de faza mobilă şi de reactivul post-coloană are numai rol indicativ şi poate fi ajustat în funcţie de caracteristicile coloanei HPLC.NOTA 2: Răspunsul detectorului la aflatoxina B(1) depinde de temperatură, prin urmare derivaţiile trebuie compensate (fig. 3). Prin injectarea unei cantităţi fixe de standard de referinţă aflatoxină B(1) (pct. 3.13.3) la intervale regulate (de exemplu, la fiecare a treia injectare), valorile picului aflatoxinei B(1) obţinute între aceste standarde de referinţă pot fi corectate utilizând mijloace de răspuns, cu condiţia ca diferenţa dintre răspunsurile standardelor de referinţă consecutive să fie foarte mică (<10%). De aceea, injectările trebuie să fie efectuate fără întrerupere. Dacă este necesară o întrerupere, ultima injectare înainte de întrerupere şi prima injectare după întrerupere trebuie să reprezinte standardul de referinţă (pct. 3.13.3).Întrucât curba de calibrare este lineară şi trece prin origine, cantităţile de aflatoxină B(1) din extractele din probe sunt determinate direct prin raportare la standardele adiacente.5.5.1. Setările pompei HPLCSe setează pompa HPLC (pct. 4.5) la un debit de curgere de 0,5 sau 0,3 ml/min. pentru o coloană HPLC (pct. 4.6) de 5 æm sau de 3 æm, respectiv folosind faza mobilă (pct. 3.6).5.5.2. Setările pompei post-coloanăSe setează pompa (pct. 4.7) la un debit de curgere de 0,2 până la 0,4 ml/min. pentru soluţie saturată apă-iod. Debite de aproximativ 0,4 sau 0,2 ml/min. sunt recomandate în combinaţie cu debite de 0,5, respectiv 0,3 ml/min. pentru faza mobilă (pct. 3.6).5.5.3 Detector cu fluorescenţăSe setează detectorul cu fluorescenţă (pct. 4.11) la excitaţie de 365 nm şi emisie de 435 nm (instrument de filtrare; > 400 nm). Se ajustează atenuatorul detectorului pentru a obţine aproximativ 80% din totalul devierii vârfului dispozitivului de înregistrare pentru 1 ng de aflatoxină B(1) .5.5.4. InjectorPentru toate soluţiile se injectează o cantitate de 250 æl, urmând instrucţiunile producătorului injectorului.5.5.5. Verificarea separării cromatograficeSe injectează soluţia pentru test cromatografic (pct. 3.14.1). Şanţurile trebuie să fie mai mici de 5% din suma înălţimilor muchiilor adiacente.5.5.6. Verificarea stabilităţii sistemuluiÎnaintea fiecărei serii de analize se injectează standardul de referinţă (pct. 3.13.3) până ce se ating suprafaţele stabile ale muchiilor. (NB: Reacţia suprafeţei de aflatoxină B(1) , între injectări consecutive, nu trebuie să difere cu mai mult de 6%). Se începe imediat verificarea linearităţii (pct. 5.5.7).5.5.7. Verificarea linearităţiiSe injectează soluţie de calibrare aflatoxină B(1) (pct. 3.13.1 la pct. 3.13.4).Pentru evitarea aglomerărilor în reacţie, la fiecare a treia injectare se va utiliza standard de referinţă (pct. 3.13.3) (NB: Reacţia suprafeţei superioare în cazul acestui standard de referinţă nu trebuie să difere cu mai mult de 10% în 90 min.). Se corectează aglomerările conform formulei de la punctul 7. Graficul de calibrare trebuie să fie linear şi să treacă prin origine între două erori standard pe Y. Valorile obţinute nu trebuie să difere cu mai mult de 3% de valorile nominale. Dacă aceste condiţii sunt îndeplinite, se continuă fără întârziere. Dacă nu, se identifică şi se corectează sursa problemelor de a continua.5.5.8. Injectarea extractelor din probeSe injectează extractele din probe purificate (pct. 5.4.2.2). După fiecare două extracte din probe se repetă injectarea de standard de referinţă (pct. 3.13.3), conform următoarei secvenţe: standard de referinţă, extract, extract, standard de referinţă, extract, extract, standard de referinţă etc.6. Test de confirmare6.1. Tratarea în continuare a extractului (pct. 5.4.2.2)Se adaugă 5 ml soluţie de clorură de sodiu (pct. 3.15.1) extractului obţinut la pct. 5.4.2.2. Se extrag de 3 ori câte 2 ml cloroform (pct. 3.1) pentru un minut, în pâlnia de separare (pct. 4.24.1). Se scurg extractele combinate cu cloroform peste aproximativ 1 g sulfat de sodiu (pct. 3.15.2) într-un tub pentru test de 10 ml. O pâlnie mică (diametru: 4 cm, poate fi folosită împreună cu o cârpă din bumbac în partea de scurgere, acoperită cu aproximativ 1 g sulfat de sodiu.Se spală stratul de sulfat de sodiu cu câţiva ml cloroform şi se colectează soluţia rezultată în acelaşi tub pentru test. Se evaporă extractul de cloroform până la uscare, în acelaşi tub pentru test, utilizând un bloc pentru încălzire (pct. 4.24.2) şi se redizolvă în 1 ml cloroform.6.2. Pregătirea cromatografiei derivate şi în strat subţire:A se vedea metoda A, pct. 5.6.2.7. Calcularea rezultatelorSe calculează conţinutul de aflatoxină B(1) (æm/kg) prezent în probă, după formula:                                                  m x V(ext)    Conţinutul de aflatoxină B(1) în emg/kg = ------------------ ,                                                           V(f)                                              V(m) x M x ------                                                           V(c)unde:m = cantitatea în ng de aflatoxină B(1) reprezentată prin partea superioară B(1) a probei, calculată după cum urmează:               P(proba)     m = ------------------- x 2r(st),         P(st(1)) + P(st(2))unde:P(proba) = suprafaţa superioară a aflatoxinei B(1) pentru probă;P(st(1)) = suprafaţa superioară a aflatoxinei B(1) rezultată din injectarea precedentă, cu standard de referinţă (pct. 3.13.3);P(st(2)) = suprafaţa superioară a aflatoxinei B(1) rezultată din injectarea următoare, cu standard de referinţă (pct. 3.13.3);r(st) = cantitatea de aflatoxină B(1) în ng injectată în standardul de referinţă (pct. 3.13.3);V(m) = volumul în ml extras din probă injectat;V(ext) = volumul final în ml de extras din probă;M = masa în g a probei;V(f) = volumul în ml de filtrat transferat în cartuşul florisil (pct. 5.4.1.2);V(c) = volumul în ml de cloroform utilizat pentru extragerea probei.Dacă procedura este conformă acestui protocol, formula se reduce la:conţinutul de aflatoxină B(1) în æg/kg = 20 x m.7.1. Calcularea rezultatelor poate, de asemenea, să fie efectuată măsurând înălţimea suprafeţei superioare.8. RepetabilitateA se vedea pct. 10.19. ReproductibilitateA se vedea pct. 10.110. Observaţii10.1. PrecizieUn studiu colaborativ^1) efectuat la nivel internaţional asupra furajelor amestecate a ajuns la rezultatele pentru repetabilitate şi reproductibilitate indicate în tabelul 1. Termenul repetabilitate (r) utilizat aici este definit ca fiind cea mai mare pondere nesemnificativă la nivelul de probabilitate de 95% pentru compararea a două citiri ale aceleiaşi probe, în acelaşi laborator, în condiţii similare. Termenul reproductibilitate (R) este definit similar pentru compararea în cazul a două laboratoare diferite. În conformitate cu ISO 3534 - 1977, 2,35^2) şi cu Decizia Comisiei 89/610/CEE^3), r şi R sunt daţi, de asemenea, în tabelul 1 drept coeficienţi de variaţie.----^1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. şi Paulsch, W.E. (1991). Aditivi şi Contaminanţi Alimentari 8, 17-29.^2) ISO 3534-1977^3) JO nr. L 351, 2.12.1989, p. 39.Tabelul 1Repetabilitatea (r) şi reproductibilitatea (R) exprimate proporţional şi coeficienţii de variaţie corespondenţi (15 laboratoare)
               
      NivelrRCV(r)*)CV(R)
      (μg/kg)     (%)(%)
      8 141,41,71118
    ---- Notă *) CV = coeficient de variaţie10.2. Stabilizarea cloroformului (pct. 3.1)Caracteristicile de absorbţie ale cartuşului de florisil pot fi schimbate dacă sunt utilizaţi alţi stabilizatori decât etanolul. Trebuie să fie verificată conformitatea cu pct. 10.3, în cazul în care cloroformul descris nu este disponibil.10.3. AcurateţeAplicarea corectă a metodei trebuie să fie verificată prin efectuarea de măsurători repetate asupra materialelor de referinţă certificate. În cazul în care acestea nu sunt disponibile, performanţa metodei trebuie să fie verificată prin experimente repetate asupra unor probe blank îmbunătăţite. Devierea valorii medii de la valoarea actuală, exprimată în procente din valoarea actuală, nu trebuie să depăşească limitele de -20% până la +10%.Figura 1: Ansamblul coloană-cartuş Figura 2: Schema de curgere a sistemului LC de derivatizare post-coloană cu iodFigura 3: Compensarea aglomerării în răspunsul aflatoxinei B prin injectarea standardului de referinţă (3.13.3) la intervale regulate de timpC. Observaţii privind metodele A şi B1. DegresareProbele ce conţin mai mult de 5% grăsimi trebuie să fie degresate cu eter de petrol (bp 40°C până la 60°C) după preparările indicate la pct. 5.1.În astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie să fie exprimate în funcţie de masa probei nedegresate.2. Reproductibilitatea rezultatelor pentru metoda AReproductibilitatea rezultatelor, de exemplu, variaţia dintre rezultatele obţinute în două sau mai multe laboratoare privind aceeaşi probă, a fost estimată la:±50% din valoarea medie pentru valorile medii ale aflatoxinei B(1) de la 10 şi până la 20 æg/kg;±10 æg/kg din valoarea medie pentru valori medii mai mari de 20 şi până la 50 æg/kg;±20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50 æg/kg.  +  Apendice--------la norma sanitară veterinară----------------------------Figurile 1 Figura 2Figura 3 -------